| 1 章 遺伝子クローニングと入手方法 佐々木博己 |
| A 通常のcDNA クローニングと入手方法 18 |
| A-1. cDNA ライブラリーから cDNA を手に入れる 18 |
| A-1 (1) mRNA を調製する 18 |
| (1)-1◆細胞質RNA の調製 18 |
| (1)-2 ◆総細胞RNA の調製 18 |
| ■AGPC 法 18 |
| その他の方法 19 |
| ・グアニジン/セシウムTFA 法, 塩化リチウム/尿素法 |
| (1)-3 ◆mRNA の分離 19 |
| ■オリゴ (dt) 付加させた担体を用いる 19 |
| ■細胞や組織の溶解, mRNA の分離が一括化された方法 19 |
| A-1 (2) cDNA ライブラリーの作製とスクリーニング 19 |
| (2)-1 ◆cDNA の合成 19 |
| ■Gubler-Hoffman法 19 |
| ■リンカー/アダプタープライマー法 20 |
| その他の方法 21 |
| ・Okayama (岡山)-Berg 法 |
| (2)-2 ◆ファージとのライゲーション(コンカテマーの形成) 21 |
| (2)-3 ◆in vitroパッケージング 21 |
| (2)-4 ◆ライブラリーの購入 21 |
| ■既製 cDNA ライブラリーの購入 21 |
| (2)-5 ◆ファージのプレーティング 22 |
| (2)-6 ◆DNA の塩基配列の相同性を利用して選別する(スクリーニング) 22 |
| (2)-7 ◆完全長cDNA をもつクローンを選択する 23 |
| ■遺伝子の塩基配列がわかっている場合 23 |
| ■部分的な塩基配列しか情報がない場合や新しい遺伝子の場合 23 |
| その他の方法 23 |
| 『平均化ライブラリーの作製方法』 |
| ・PCR で増幅したcDNA からつくる方法 |
| ・mRNA からつくる方法 |
| ・一本鎖プラスミドcDNA ライブラリーからつくる方法 |
| A-2. PCR によってcDNA を手に入れる 24 |
| ■RT-PCR 法 24 |
| その他の方法 24 |
| ・degenerate プライマーを用いたPCR法 |
| A-3. 公的保存施設からの譲渡, 市販のカタログショッピング 25 |
| A-3 (1) 公的遺伝子供給施設 25 |
| ■ATCC 25 |
| ■JCRB 遺伝子バンク 25 |
| ■理研バイオリソースセンター 25 |
| ■農林水産DNAバンク 25 |
| ■FANTOM project 25 |
| A-3 (2) 市販のカタログショッピング 25 |
| ■MGC Full Length cDNA Collection 25 |
| ■True Clone Collection 25 |
| ■GeneStorm 発現用遺伝子リソース 25 |
| ■Gene Copoeia ORF クローン 25 |
| ■遺伝子スクリーニング受託 25 |
| A-4. 人からの供与 26 |
| B 遺伝子の発現量や機能をもとにしたクローニング 27 |
| B-1. 合成オリゴヌクレオチドによるcDNA ライブラリーのスクリーニング 27 |
| B-2. mRNA の発現量の差をもとにcDNA を手に入れる 27 |
| B-2 (1) cDNA ディファレンシャルハイブリダイゼーション法 28 |
| B-2 (2) cDNA サブトラクション法 28 |
| ■cDNA-RDA 法 29 |
| ■CCLS 法 30 |
| ■一本鎖 cDNA のハイドロキシアパタイトカラムによる精製 30 |
| その他の方法 31 |
| ・EDS 法 |
| ・ビオチン化ドライバー cDNA によるテスター cDNA の吸収法 |
| B-2 (3) mRNA フィンガープリント法 31 |
| ■DD 法 31 |
| ■RAP-PCR 法 32 |
| ■FDD 法 32 |
| B-3. cDNA の発現クローニング 32 |
| B-3 (1) 抗体をプローブとする cDNA クローニング 33 |
| ■ウエスタン法の応用 33 |
| B-3 (2) 細胞にmRNAやcDNAを導入して目的のcDNAのみを分離する 33 |
| ■アフリカツメガエル卵母細胞を用いた発現クローニング 33 |
| ■COS細胞を用いた発現クローニング 34 |
| ■酵母を宿主とした動物細胞cDNAの相補クローニング 34 |
| B-3 (3) タンパク質-タンパク質相互作用を利用してcDNAを手に入れる 34 |
| ■ウエストウエスタン法またはファーウエスタン法 34 |
| ■酵母two-hybrid法 35 |
| B-3 (4) DNA-タンパク質相互作用を利用してcDNAを手に入れる 37 |
| ■サウスウエスタン法 37 |
| ■COS細胞を用いた発現クローニング 37 |
| C 同定したcDNAの塩基配列の決定とホモロジーサーチ 38 |
| C-1. 塩基配列の決定 38 |
| C-1 (1) キャピラリー電気泳動方式 40 |
| ■ABI PRISM310 40 |
| ■ABI PRISM3100 40 |
| ■Beckman Coulter CEQ2000 40 |
| その他の方法 40 |
| 『大規模シークエンス解析装置』 |
| ・ABI PRISM3700 |
| ・Molecular Dynamics MegaBASE1000 |
| ・島津RISA-384 |
| C-1 (2) スラブゲル電気泳動方式 40 |
| ■ABI377 41 |
| ■Pharmacia ALF 41 |
| ■日立SQ-5500 41 |
| ■LI-Cor 41 |
| C-2. ホモロジー検索 41 |
| C-2 (1) 核酸, アミノ酸のデータベースと検索プログラム 41 |
| (1)-1 ◆データベース 41 |
| ■核酸のデータベース 41 |
| ■タンパク質のデータベース 41 |
| ■統合型データベース 41 |
| (1)-2 ◆核酸, アミノ酸の双方向検索プログラム 42 |
| ■blastn 42 |
| ■blastp 42 |
| ■tblast 42 |
| ■blastx 42 |
| ■tblastx 42 |
| (1)-3 ◆機能, ドメインの予測プログラム 42 |
| ■PSI-BLAST 42 |
| ■CLUSTALW 42 |
| C-2 (2) モチーフデータベース 42 |
| ■PROSITE 43 |
| ■BLOCKS 43 |
| ■Pfam 43 |
| 2 章 抗体の入手, タンパク質の精製とアミノ酸配列決定 吉田真太郎 |
| A 抗体を入手する 46 |
| A-1. 抗体を購入する 46 |
| A-2. 抗体を作製する 46 |
| A-2 (1) ポリクローナル抗体 47 |
| A-2 (2) モノクローナル抗体 47 |
| B タンパク質の精製とアミノ酸配列決定 49 |
| B-1. 生体, 細胞からタンパク質を手に入れる 49 |
| B-1 (1) タンパク質を分画する 49 |
| ■分泌タンパク質の分画法 49 |
| ■細胞質タンパク質の分画法 49 |
| ■核内タンパク質の分画法 50 |
| ■膜タンパク質の分画法 50 |
| ■ミトコンドリアの分画法 50 |
| ■ミクロソームタンパク質の分画法 51 |
| B-1 (2) タンパク質を分離・精製する 51 |
| (2)-1◆沈降法 51 |
| ■硫安沈殿 51 |
| その他の方法 51 |
| ・有機溶媒によるタンパク質の沈殿 |
| (2)-2 ◆電気泳動法 51 |
| ■ポリアクリルアミド (PAGE) 電気泳動法 51 |
| ■等電点電気泳動法 52 |
| ■二次元電気泳動法 52 |
| (2)-3 ◆カラムクロマトグラフィー 52 |
| ■ゲル濾過クロマトグラフィー 52 |
| ■イオン交換クロマトグラフィー 53 |
| ■疎水クロマトグラフィー 53 |
| ■逆相クロマトグラフィー 53 |
| ■アフィニティークロマトグラフィー 53 |
| (2)-4 ◆その他 55 |
| ■限外濾過 55 |
| ■透析 55 |
| B-2. アミノ酸配列(一次構造)の決定 55 |
| B-2 (1) アミノ酸配列分析用タンパク質の調製 55 |
| (1)-1◆ジスフィルド結合の切断と修飾 55 |
| (1)-2◆タンパク質の断片化 56 |
| ■酵素的な断片化 56 |
| その他の方法 56 |
| ・化学的な断片化 |
| B-2 (2) アミノ酸配列 (一次構造) 決定 56 |
| (2)-1◆Edman分解法 56 |
| (2)-2◆質量分析(マススペクトロメーター) 57 |
| ■TOF MASS 57 |
| ■MASS/MASS 58 |
| 3 章 遺伝子産物の生化学的解析 吉田真太郎 |
| A タンパク質の酵素活性を解析する 62 |
| A-1. タンパク質の入手 62 |
| ■大腸菌に生産させる 62 |
| ■真核細胞に生産させる(バキュロウイルス合成系など) 62 |
| A-2. 酵素活性を測定する 62 |
| A-2 (1) キナーゼ活性測定 63 |
| ■キナーゼ活性をもつ酵素タンパク質 63 |
| ■自己をリン酸化する酵素タンパク質 63 |
| A-2 (2) その他の活性測定 63 |
| ■脱リン酸化酵素 63 |
| ■補酵素を必要とする酵素タンパク質 63 |
| B タンパク質の局在性の検定を行う 64 |
| B-1. 免疫染色法(免疫組織化学染色法) 64 |
| B-1 (1) 免疫染色法の種類 64 |
| ■間接法 64 |
| ■ABC 法 64 |
| ■PAP 法 64 |
| その他の方法 65 |
| ・直接法 |
| B-1 (2) 標識物質 65 |
| ■HRP 65 |
| ■ALP 65 |
| ■蛍光物質 65 |
| ■重金属(金粒子など)で標識した二次抗体 65 |
| B-2. 免疫電顕法 65 |
| ■重金属標識法 65 |
| ■ABC 法 65 |
| ■酵素標識法 66 |
| ■プロテインA 法 66 |
| B-3. GFP を利用した局在性検定 66 |
| C タンパク質-タンパク質の相互作用を調べる 67 |
| C-1. 融合タンパク質を用いて目的のタンパク質の検出を行う 67 |
| C-1 (1) 融合タンパク質の作製 67 |
| (1)-1◆大腸菌を利用する 67 |
| ■GST 融合タンパク質合成系 67 |
| ■His-tag 融合タンパク質合成系 68 |
| (1)-2 ◆真核細胞を利用する 68 |
| ■Saccharomyces 合成系 68 |
| ■バキュロウイルス合成系 68 |
| C-1 (2) 融合タンパク質の精製 68 |
| ■グルタチオンアフィニティークロマトグラフィー 68 |
| ■金属キレートアフィニティークロマトグラフィー 68 |
| C-2. 抗体を用いて目的のタンパク質の検出を行う 69 |
| C-2 (1) 合成ペプチドを利用した抗原の作製 69 |
| ■合成ペプチド 69 |
| ■Saccharomyces 合成系 69 |
| ■バキュロウイルス合成系 70 |
| C-2 (2) 目的タンパク質の検出 70 |
| ■免疫沈降法 70 |
| ■ウエスタンブロッティング 70 |
| C-3. 表面プラズモン共鳴法 71 |
| C-4. 蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)法 71 |
| C-5. プロテオーム解析 72 |
| ■二次元電気泳動法 73 |
| ■LC-MS 法 73 |
| D DNA-タンパク質の相互作用を調べる 74 |
| D-1. DNA 結合因子の解析 74 |
| ■ゲルシフト法(EMSA) 74 |
| ■表面プラズモン共鳴法 74 |
| その他の方法 75 |
| ・DNase Ⅰフットプリント法 |
| ・サウスウエスタン法 |
| D-2. DNA非結合因子の解析 75 |
| ■two-hybrid法 75 |
| ■ファーウエスタン法 75 |
| ・UV クロスリンク法 |
| D-3. クロマチン免疫沈降(ChIP)法 76 |
| E タンパク質の修飾を解析する 77 |
| E-1. リン酸化の解析 77 |
| E-1 (1) リン酸化タンパク質の検出 77 |
| E-1 (2) リン酸化アミノ酸の分析 77 |
| E-2. タンパク質に付加した複合糖鎖の解析 78 |
| E-2 (1) 糖タンパク質の分離・精製 78 |
| E-2 (2) 糖鎖の切断 78 |
| ■酵素的処理 78 |
| ■化学的方法 78 |
| E-2 (3) 糖鎖の同定 79 |
| E-3. その他の翻訳後修飾の解析 79 |
| ■ユビキチンとユビキチン様タンパク質による修飾の解析 79 |
| ■アセチル化の解析 79 |
| ■メチル化の解析 79 |
| ■脂質修飾の解析 80 |
| 4 章 遺伝子の発現解析 落谷孝広 |
| A 目的のmRNA の発現している組織, 細胞, 量, それに時期, 期間を知る 84 |
| A-1. cDNAセットの購入 84 |
| A-2. mRNAフィルター, ポリA mRNAアレイの購入 85 |
| A-3. mRNAの抽出方法 85 |
| ■一般のノーザンハイブリダイゼーション法やドットブロット法でmRNA定量を行う場合 85 |
| ■発現量が少ない, クロスハイブリダイゼーションが問題になる場合, またcDNAライブラリー作製の際 85 |
| ■発現量の見当がつかない場合 85 |
| A-4. 発現情報解析の方法:核酸レベル 85 |
| A-4 (1) ノーザンハイブリダイゼーション法 85 |
| その他の方法 86 |
| ・エチジウムブロマイド法 |
| ・ハイブリダイゼーション法 |
| ・RNAドットブロット法 |
| A-4 (2) RNaseプロテクションアッセイ法(リボプローブマッピング) 87 |
| A-4 (3) RT-PCR 法 87 |
| A-4 (4) リアルタイムPCR 法 87 |
| A-4 (5) DNAチップ/マイクロアレイ法 87 |
| A-5. 発現情報解析の方法:細胞・組織レベル 88 |
| A-5 (1) in situハイブリダイゼーション(ISH)法 88 |
| (1)-1 ◆組織切片の作製 89 |
| ■新鮮凍結切片 89 |
| ■パラフィン包埋標本 89 |
| ■灌流固定標本 89 |
| (1)-2 ◆プローブの選択 89 |
| ■オリゴプローブ 89 |
| ■RNAプローブ 90 |
| (1)-3 ◆プローブの標識法の選択 90 |
| ■アイソトープ標識 90 |
| ■非アイソトープ標識 90 |
| A-5 (2) in situ RT-PCR 法 91 |
| A-5 (3) 核run-on アッセイ法 91 |
| A-5 (4) マイクロダイセクション法 92 |
| A-5 (5) 組織アレイによる遺伝子発現解析法 92 |
| B 目的のmRNA の発現調節機構を調べる 93 |
| B-1. 発現はどのレベルで調節されているのかを知る 93 |
| B-1 (1) 転写レベルでの調節 93 |
| (1)-1 ◆転写調節領域を含む遺伝子断片のクローニング 94 |
| ■目的とする遺伝子のcDNA がすでにクローニングされている場合 94 |
| ■アミノ酸配列のN末端が同定されている場合 94 |
| (1)-2 ◆クローニングの方法の概要 94 |
| ■ゲノムDNA ライブラリーの準備 94 |
| ■ゲノムDNA ライブラリーのスクリーニング 94 |
| B-1 (2) 転写後の各段階で調節されている場合 95 |
| B-2. 発現調節領域の同定 95 |
| B-2 (1) プロモーター解析 95 |
| (1)-1 ◆レポーター遺伝子発現アッセイ 95 |
| ■CAT(クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ) 96 |
| ■ルシフェラーゼ 96 |
| ■β-ガラクトシダーゼ 96 |
| ■GFP(緑色蛍光タンパク質) 96 |
| その他の方法 97 |
| ・β-グルクロニダーゼ(GUS) |
| (1)-2 ◆欠失変異体による発現調節領域の解析 97 |
| (1)-3 ◆DNase Ⅰ感受性テスト 97 |
| (1)-4 ◆S1 マッピング 97 |
| (1)-5 ◆リボプローブマッピング(RNase プロテクションアッセイ) 98 |
| (1)-6 ◆プライマー伸長法 98 |
| B-2 (2) エンハンサーの同定 99 |
| B-2 (3) in vitro転写系 99 |
| (3)-1 ◆in vitro転写活性を有する細胞抽出液の調製 100 |
| ■全細胞抽出液 100 |
| ■核抽出液 100 |
| (3)-2 ◆in vitro 転写反応 100 |
| ■run-off 転写法 100 |
| ■G-free カセット法 101 |
| B-3. 転写後の調節機構を知る 101 |
| B-3 (1) microRNA による発現調節を知る 101 |
| (1)-1 ◆未知のmiRNA を探索する場合 101 |
| (1)-2 ◆既知のmiRNA の発現プロファイルを解析する場合 101 |
| B-4. エピジェネティクスによる遺伝子発現調節 102 |
| ■PCR 法によってメチル化の有無を検出する方法 102 |
| C 転写制御因子を解析する 103 |
| C-1. 転写因子の解析 103 |
| ■ゲルシフト法 103 |
| ■DnaseⅠフットプリント法 103 |
| ■メチル化フットプリント法 103 |
| ■UV クロスリンク法 103 |
| C-2. 転写因子の精製 104 |
| ■DNA アフィニティークロマトグラフィー法 104 |
| ■DNA アフィニティーラテックス粒子法(バッチ法による) 104 |
| ■ビオチン-ストレプトアビジンを用いる精製システム 104 |
| その他の方法 104 |
| ・バッチ法 |
| C-3. 目的遺伝子と転写因子の相互作用 105 |
| C-3 (1) チロシンリン酸化抗体による解析方法 105 |
| C-3 (2) In-gel タンパク質リン酸化アッセイ法 105 |
| C-3 (3) レポーターアッセイシステム(キット) 105 |
| 5 章 細胞・生体レベルの遺伝子機能解析 落谷孝広 |
| A 培養細胞への遺伝子導入と発現 108 |
| A-1. 人工変異の導入方法 108 |
| A-1 (1) 合成オリゴヌクレオチドによる位置指定変異導入法 108 |
| ■PCR 法 108 |
| その他の方法 109 |
| ・ギャップDNA 法, ウラシルDNA 法 |
| A-1 (2) 領域指定変異導入法 109 |
| ■古典的なエキソヌクレアーゼによる欠失法 109 |
| ■亜硝酸による領域指定変異導入法 110 |
| A-2. 発現ベクターのデザイン 110 |
| A-2 (1) プロモーター・エンハンサーの選択 110 |
| (1)-1 ◆幅広い細胞種を標的にする場合のプロモーター・エンハンサー 111 |
| ■サイトメガロウイルス(CMV)のプロモーター 111 |
| ■チミジンキナーゼ(TK)プロモーター 111 |
| ■ニワトリβ-アクチンのプロモーター 111 |
| ■SV40 初期遺伝子プロモーター 111 |
| ■CAG プロモーター 111 |
| (1)-2 ◆細胞・組織特異的プロモーター・エンハンサー 111 |
| A-2 (2) 発現調節用ベクターの選択 111 |
| ■大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンを利用した系 111 |
| ■Cre-loxP システム 112 |
| ■FLP/FRT システム 113 |
| A-3. 培養細胞への遺伝子導入の方法論 113 |
| A-3 (1) 生物学的方法 113 |
| (1)-1 ◆ウイルスベクター 113 |
| (1)-2 ◆特異的受容体を利用する方法 114 |
| (1)-3 ◆細胞融合法 114 |
| ■HVJ(センダイウイルス) 114 |
| ■ポリエチレングリコール(PEG) 114 |
| ■電気的細胞融合法 115 |
| A-3 (2) 物理的方法 115 |
| ■マイクロインジェクション法 115 |
| ■エレクトロポレーション法 115 |
| ■ジーンパーティクル(gene gun) 115 |
| その他の方法 116 |
| ・pH, 磁気, 超音波 |
| A-3 (3) 化学的方法 116 |
| ■リン酸カルシウム沈殿法 116 |
| ■リポソーム法 116 |
| ■DEAE デキストラン法 117 |
| ■プロトプラスト法 117 |
| ■赤血球ゴースト法, 赤血球膜ゴースト法 117 |
| ■マイクロカプセル法 117 |
| A-4. 遺伝子組み込み細胞株の樹立 117 |
| A-4 (1) 選択マーカー遺伝子の選択 118 |
| ■neo(ネオマイシン)耐性遺伝子 118 |
| ■pSV2neo やpRSVneo 遺伝子 118 |
| ■ハイグロマイシン耐性遺伝子(ハイグロマイシントランスフェラーゼ遺伝子) 118 |
| A-4 (2) 薬剤耐性細胞株の樹立 118 |
| A-4 (3) 遺伝子発現細胞株のスクリーニング 119 |
| ■DNA の調製 119 |
| ■RNA の調製 119 |
| ■タンパク質の調製 119 |
| ■セルソーターによる選別法 119 |
| ■細胞染色法 119 |
| ■ELISA 119 |
| ■フォーカスフォーミングアッセイ 120 |
| ■細胞の浸潤能や運動能の測定 120 |
| ■マウスなどの動物への細胞の移植 120 |
| A-5. レポーター遺伝子導入と発現アッセイ法 120 |
| B オリゴヌクレオチドの導入による遺伝子の機能解析 121 |
| B-1. アンチセンスオリゴヌクレオチドのデザインと全体のプロトコール 121 |
| B-1 (1) ターゲット部位デザイン 121 |
| B-1 (2) プロトコール 121 |
| (2)-1 ◆オリゴヌクレオチドの精製 121 |
| (2)-2 ◆オリゴヌクレオチドの修飾 122 |
| ■S-化修飾 122 |
| ■アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド(AMO) 122 |
| その他の方法 122 |
| ・メチル化修飾, アクリジン修飾, アセチレン炭化水素修飾 |
| (2)-3 ◆実験系の確立 122 |
| B-2. 培養細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの導入 123 |
| ■カチオン性リポソームによる遺伝子導入方法の応用 123 |
| ■アンチセンス配列を発現ベクターに組み込む 123 |
| ■Antennapedia ペプチド法 123 |
| B-3. RNAi 法のデザイン 123 |
| B-3 (1) 標的遺伝子に対するsiRNA の配列設計 124 |
| B-3 (2) siRNA 配列の特異性の確認 125 |
| B-3 (3) 合成siRNA か, ベクター型siRNA かの選択 125 |
| ■合成siRNA の場合 125 |
| ■siRNA 発現プラスミドベクター(shRNA)の場合 126 |
| ■siRNA 発現ウイルスベクターの場合 126 |
| B-3 (4) 細胞, 動物への導入 127 |
| C 動物個体への遺伝子導入 128 |
| C-1. トランスジェニック 128 |
| C-1 (1) トランスジェニック動物作製 128 |
| ■マイクロインジェクション法 129 |
| ■レトロウイルス感染法 129 |
| その他の方法 129 |
| ・アデノウイルス感染法 |
| ■胚性幹細胞(ES 細胞)を用いる方法 129 |
| C-1 (2) 各種トランスジェニック動物 129 |
| (2)-1 ◆トランスジェニックマウス 130 |
| (2)-2 ◆トランスジェニックラット 130 |
| (2)-3 ◆その他 131 |
| C-2. ノックアウト 131 |
| C-2 (1) ノックアウトマウス作製 131 |
| (1)-1 ◆ES 細胞によるノックアウトマウス作製 131 |
| ■ターゲティングベクターの構築 132 |
| ■ES 細胞への導入 133 |
| (1)-2 ◆saturation mutagenesis による変異マウス作製 133 |
| C-2 (2) その他のノックアウト動物 133 |
| C-2 (3) その他の個体レベルでの遺伝子機能の抑制方法: RNAi 法… 133 |
| C-3. 生体への全身あるいは局所的遺伝子導入法 134 |
| ■直接遺伝子導入法 134 |
| ■カチオン性リポソームによる方法 134 |
| ■HVJ-リポソーム法 134 |
| ■ウイルスベクター 135 |
| ■in vivo エレクトロポレーション法 135 |
| ■ミセル化ナノ粒子法 135 |
| ■バイオマテリアルによる遺伝子導入法 135 |
| C-4. 個体レベルでのイメージング解析 135 |
| ■バイオフォトニクス 136 |
| その他の方法 136 |
| ・イメージング機器 |
| 動物個体の大量変異株のバンク状況と取得のための利用法 137 |
| ■ジャクソン研究所のホームページ 137 |
| ■Lexicon genetics 社のホームページ 137 |
| ■Federation of International Mouse Resources のホームページ 137 |
| 6 章 幹細胞(ES細胞, 間葉系幹細胞)を用いた実験法 落谷孝広 |
| A ES 細胞の樹立と培養, 保存などの基礎技術 140 |
| A-1. ES 細胞の取り扱い 141 |
| A-1 (1) ES 細胞の入手 141 |
| A-1 (2) ES 細胞の培養 142 |
| A-1 (3) ES 細胞の保存 142 |
| A-1 (4) フィーダー細胞の取り扱い 142 |
| ■EMFI 142 |
| ■STO 142 |
| A-2. ES 細胞への遺伝子導入 143 |
| A-2 (1) ES 細胞に導入可能な遺伝子ベクター 143 |
| A-2 (2) 遺伝子導入の方法… 143 |
| A-3. ヒトES 細胞の入手などについての情報 144 |
| B ES 細胞の分化誘導系を用いた遺伝子機能解析 145 |
| B-1. ES 細胞を用いた遺伝子機能解析の戦略 145 |
| B-2. ES 細胞のin vitro 分化誘導 145 |
| B-2 (1) 培養シャーレ上での分化誘導 146 |
| ■LIF なしフィーダー細胞なしでの分化誘導 146 |
| ■特殊物質(マトリックス)による分化誘導 146 |
| ■特殊フィーダー細胞による分化誘導 146 |
| B-2 (2) 胚様体を介したin vitro 分化誘導 148 |
| B-3. ES 細胞のin vivo 分化誘導 148 |
| C 間葉系幹細胞 150 |
| C-1. 間葉系幹細胞の入手 151 |
| C-2. 間葉系幹細胞の培養 151 |
| C-3. 間葉系幹細胞の分化 151 |
| 7 章 ポストゲノムとしての網羅的遺伝子研究 佐々木博己 |
| A 癌を含む疾患原因遺伝子の分離・同定 154 |
| A-1. ポジショナルクローニングによる遺伝性疾患の原因遺伝子の同定 154 |
| A-1 (1) 古典的な多型マーカーを用いた連鎖解析による原因遺伝子座の決定 155 |
| (1)-1◆多型性の検定法 155 |
| ■RFLP(制限断片長多型)を利用 155 |
| ■VNTR を利用 155 |
| ■CA リピートを利用 155 |
| A-1 (2) SNPs を利用した疾患関連遺伝子の同定 156 |
| ■dbSNP 156 |
| ■HGVbase 156 |
| ■ALFRED 156 |
| ■CGAP SNP index 156 |
| ■JSNP 157 |
| ■SNP Database Network in Japan 157 |
| ■JG-SNP 157 |
| ■International HapMap Project 157 |
| ■TSC 157 |
| (2)-1◆SNPs を利用した疾患関連遺伝子の同定法 158 |
| ■アソシエーション法 158 |
| ■罹患同胞対法 158 |
| ■伝達不平衡解析法 158 |
| A-2. ポジショナルクローニングによる非遺伝性の癌の原因遺伝子の同定 158 |
| A-2 (1) 染色体の構造異常の同定 158 |
| (1)-1◆LOH の解析 159 |
| (1)-2 ◆CGH 法 159 |
| (1)-3 ◆アレイCGH 法 160 |
| (1)-4 ◆ゲノムフィンガープリント法 160 |
| ■RLGS 法 160 |
| ■AP-PCR 法 161 |
| (1)-5 ◆ゲノムサブトラクション法 162 |
| ■RDA 法 162 |
| その他の方法 162 |
| ・In-gel renaturation 法 |
| ・IGCR 法 |
| ・SIA 法 |
| A-2 (2) 染色体の転座・逆位部位の同定 163 |
| ■染色体の観察(カリオタイピング) 163 |
| ■two color FISH 法 163 |
| ■multiple color FISH 法 164 |
| ■細胞分裂前期染色体でのFISH 法 164 |
| ■DNA ファイバーFISH 法 164 |
| A-2 (3) メチル化異常の同定 164 |
| A-3. 候補遺伝子の同定 164 |
| A-3 (1) データベースを利用する方法 165 |
| ■NCBI やUCSC のゲノムデータベースを利用する方法 165 |
| ■データベースを利用した in silico 遺伝子同定法 165 |
| A-3 (2) 実験的に未知遺伝子を分離する方法 165 |
| ■exon amplification /exon trapping 法 165 |
| ■cDNA セレクション法 166 |
| その他の方法 167 |
| ・BAC, P1 クローンを直接にプローブとする方法 |
| ・SPM 法 |
| A-4. 遺伝子変異の同定 167 |
| A-4 (1) 大きな変化を検索する方法 167 |
| ■サザンハイブリダイゼーション法 167 |
| ■ノーザンハイブリダイゼーション法 168 |
| A-4 (2) 点突然変異を含む微細な変化を検索する方法 168 |
| ■塩基配列の決定 168 |
| ■DGGE(変性剤濃度勾配ゲル電気泳動)法 168 |
| ■SSCP 法 169 |
| ■WAVER 核酸フラグメント解析システムを用いた全自動フラグメント解析 169 |
| その他の方法 170 |
| ・RPA 法 |
| ・オリゴヌクレオチドアレイによる方法 |
| B ゲノム網羅的遺伝子機能解析 171 |
| B-1. トランスクリプトーム関連技術 171 |
| ■SAGE 法 172 |
| ■iAFLP/ATAC-PCR 法 174 |
| ■網羅的な遺伝子発現解析のためのマイクロアレイ法 174 |
| ■ゲノムタイリングアレイによる新規遺伝子のハンティング法 176 |
| ■ChIP on chip によるタンパク質-DNA 複合体の解析法 177 |
| ■mi(micro)RNA の網羅的発現解析法 177 |
| B-2. プロテオーム関連技術 178 |
| 付録 効率的なバイオ実験の進めかた (佐々木博己) 179 |
| その1 ◆試薬と機器をうまく揃える方法/ |
| その2 ◆経験のない実験法を素早く導入する方法/ |
| その3 ◆バイオ実験がうまくいく方法/ |
| その4 ◆足りない実験データを早く補充する方法/ |
| その5 ◆実験時間をうまく管理する方法/ |
| その6 ◆実験技術を引き継ぐための効率のよい研究室システム/ |
| 【特別編】その7 ◆バイオ研究者への道 |
| 索引 196 |
| column―コラム |
| ゲノム新時代の包括的遺伝子発現解析方法 92 |
| シグナル伝達研究の成功の鍵 105 |
| RNAi が基礎研究から創薬・治療までをリードする 126 |
| トランスジェニック動物誕生の「歴史的背景」 138 |
| 幹細胞研究の明と暗 143 |
| non-coding RNA とsmallRNA の台頭 178 |
| 1 章 遺伝子クローニングと入手方法 佐々木博己 |
| A 通常のcDNA クローニングと入手方法 18 |
| A-1. cDNA ライブラリーから cDNA を手に入れる 18 |
| A-1 (1) mRNA を調製する 18 |
| (1)-1◆細胞質RNA の調製 18 |
| (1)-2 ◆総細胞RNA の調製 18 |
