| 第1章 代替法における工学的新技術の可能性 |
| 1. 代替法国際動向から見た新技術導入の可能性（小島肇夫） 1 |
| 1.1 動物実験代替法における新技術導入の目的 1 |
| 1.2 試験法の公定化 1 |
| 1.3 バリデーション 2 |
| 1.3.1 動物実験代替法センターの設立 2 |
| 1.3.2 バリデーションでの必須事項 2 |
| 1.4 第三者評価（Peer Review） 3 |
| 1.5 行政的な受入れ 4 |
| 1.6 おわりに 5 |
| 2. 受託機関から見た新代替法導入の可能性（関島勝） 6 |
| 第2章 デバイス・システム |
| 1. コア・シェルナノ粒子基板を用いたプラズモニック非標識細胞アッセイバイオチップ（遠藤達郎） 11 |
| 1.1 はじめに 11 |
| 1.2 プラズモニック非標識細胞アッセイバイオチップの作製および測定系の構築 12 |
| 1.3 プラズモニック非標識細胞アッセイバイオチップを用いた細胞代謝産物の非標識検出 14 |
| 1.3.1 プラズモニック非標識細胞アッセイバイオチップを用いたB細胞刺激応答の非標識検出 15 |
| 1.3.2 抗体固定化プラズモニック非標識細胞アッセイバイオチップによるIL-2の非標識検出および定量 17 |
| 1.4 おわりに 19 |
| 2. 原子間力顕微鏡と細胞機能解析（中村史） 21 |
| 2.1 はじめに 21 |
| 2.2 AFMの動作原理と分子像撮影 21 |
| 2.3 AFMを用いた相互作用測定 22 |
| 2.4 AFMによる機械的物性の評価 24 |
| 2.5 AFMの分子マニピュレーターとしての利用 24 |
| 2.6 ナノ針を挿入する細胞操作技術：セルサージェリー 25 |
| 2.7 ナノ針による高効率遺伝子導入 27 |
| 2.8 乳癌細胞を用いたホルモン製剤の試験 28 |
| 2.9 おわりに 29 |
| 3. 電極アレイシステムを用いる神経機能解析（神保泰彦，森口裕之，高山祐三） 31 |
| 3.1 神経系の電気信号とその計測 31 |
| 3.2 電極アレイ基板上での細胞培養 33 |
| 3.3 電気信号記録とデータ処理 35 |
| 3.4 薬物応答の検出 36 |
| 4. 細胞機能解析のための局所的化学刺激デバイス（安田隆） 39 |
| 4.1 はじめに 39 |
| 4.2 デバイスの構造と動作原理 39 |
| 4.3 デバイスの評価実験 42 |
| 4.4 おわりに 46 |
| 5. シングル細胞解析システム（山村昌平） 48 |
| 5.1 はじめに 48 |
| 5.2 細胞チップを用いた細胞解析システム 49 |
| 5.2.1 シングル細胞アレイチップを用いた細胞シグナル解析 49 |
| 5.2.2 マイクロ流路型チップを用いた細胞解析システム 51 |
| 5.3 まとめ 54 |
| 6. アレルギーおよび美白応答スクリーニング細胞チップ（牛島ひろみ） 56 |
| 6.1 はじめに 56 |
| 6.2 アレルギー応答スクリーニングチップ 56 |
| 6.2.1 細胞応答の検出原理 56 |
| 6.2.2 Microfluidicチップの作成 57 |
| 6.2.3 チップ表面の改質と細胞培養 58 |
| 6.2.4 Microfluidicシステムによるアレルギー応答の検出 59 |
| 6.3 美白応答スクリーニング細胞チップ 61 |
| 6.4 おわりに 64 |
| 7. 細胞機能解析チップ（新田尚，玉谷卓也） 66 |
| 7.1 はじめに 66 |
| 7.2 チップを用いた細胞走化性測定技術―TAXIScan 66 |
| 7.3 TAXIScan法で得られる疾患バイオマーカー 68 |
| 7.4 マスト細胞脱顆粒計測へのTAXIScanチップの応用 69 |
| 7.5 TAXIScanの創薬研究への応用 71 |
| 7.6 おわりに 72 |
| 第3章 マテリアルと細胞2Dパターニング |
| 1. 高分子表面の微細加工技術とスフェロイドアレイ（大塚英典） 74 |
| 1.1 はじめに 74 |
| 1.2 細胞のパターン化培養を可能とする材料基板 75 |
| 1.3 3次元培養 75 |
| 1.4 肝細胞スフェロイドマイクロアレイ 77 |
| 1.4.1 培養床のマイクロパターン形状が培養に与える影響 77 |
| 1.4.2 移植不適合検体より採取したヒト肝実質細胞を用いた肝細胞スフェロイドマイクロアレイの調製 80 |
| 1.5 おわりに 82 |
| 2. 細胞転写印刷技術（服部秀志） 84 |
| 2.1 はじめに 84 |
| 2.2 細胞転写印刷技術の概要 85 |
| 2.2.1 これまでに報告された手法 85 |
| 2.2.2 我々の手法 85 |
| 2.3 血管内皮細胞パターンの細胞外基質への転写 87 |
| 2.3.1 コーティングへの照射エネルギー量が細胞接着に及ぼす影響 87 |
| 2.3.2 培養時間あるいは細胞密度が転写時の細胞挙動に及ぼす影響 88 |
| 2.3.3 基板表面と細胞の接着の強さが転写時の細胞挙動に及ぼす影響 89 |
| 2.3.4 考察 89 |
| 2.4 おわりに 90 |
| 3. 細胞膜修飾剤（BAM）を用いた浮遊性細胞のパターニングとその応用（長棟輝行） 92 |
| 3.1 はじめに 92 |
| 3.2 BAM修飾表面上への浮遊性細胞の固定化技術の開発 92 |
| 3.2.1 BAM修飾表面の調製 93 |
| 3.2.2 BAM修飾表面上への浮遊性細胞の固定化 93 |
| 3.2.3 BAM修飾表面上での固定化細胞の培養 95 |
| 3.3 BAMを用いた浮遊性細胞のパターニング 96 |
| 3.4 BAM修飾表面上の特定領域内での固定化細胞への遺伝子導入技術の開発 98 |
| 3.4.1 BAM修飾スライドグラス上での遺伝子/リポソーム複合体の固定化と固定化細胞への遺伝子導入方法 99 |
| 3.4.2 BAM修飾カバーガラス上での固定化細胞へのRNAiの導入 100 |
| 3.4.3 BAM修飾表面上での浮遊性細胞の高密度遺伝子導入マイクロアレイの作製 100 |
| 3.5 おわりに 102 |
| 4. マイクロ空間細胞培養プレート（福田始弘，田崎剛） 104 |
| 4.1 はじめに 104 |
| 4.2 マイクロパターンの作製 105 |
| 4.3 マイクロ空間での細胞培養 105 |
| 4.3.1 細胞ネットワークの形成 105 |
| 4.3.2 マイクロウェルでの細胞重層化 108 |
| 4.4 おわりに 109 |
| 5. 光を用いたオンデマンド細胞パターニング（須丸公雄，金森敏幸） 111 |
| 5.1 はじめに 111 |
| 5.2 培養細胞の接着性を光照射で亢進する技術 112 |
| 5.3 同一微小流路内部への異種細胞の配列担持 115 |
| 5.4 細胞接着阻害を光で解除できる培養基材 116 |
| 5.5 おわりに 119 |
| 6. 細胞保持機能を有するバイオアッセイPDMSチップの構築（安保充，大久保明） 122 |
| 6.1 はじめに 122 |
| 6.2 細胞保持膜の選択 122 |
| 6.2.1 光学特性 123 |
| 6.2.2 細胞毒性 123 |
| 6.2.3 耐久性 123 |
| 6.3 細胞保持チャンバーの設計 123 |
| 6.4 PDMSチップ上での細胞培養 124 |
| 6.5 PDMSチップ上での生死細胞染色 125 |
| 6.6 放出物の評価系（生存活性測定） 125 |
| 6.7 毒性試験PDMSチップの構築 126 |
| 6.8 ヒスタミン遊離試験 127 |
| 6.9 ヒスタミン遊離抑制試験 130 |
| 6.10 おわりに 130 |
| 7. パターン化自己組織化単分子膜を利用した細胞チップ（有馬祐介，岩田博夫） 132 |
| 7.1 はじめに 132 |
| 7.2 表面官能基が細胞接着に与える影響 132 |
| 7.3 細胞のパターニング 134 |
| 7.4 細胞アレイ 135 |
| 7.4.1 細胞アレイを用いた遺伝子機能の解析 136 |
| 7.4.2 細胞アレイを用いたフィーダー細胞の探索法 137 |
| 7.5 終わりに 139 |
| 8. 細胞捕捉機能を有する新マテリアル（横山義之） 140 |
| 8.1 はじめに 140 |
| 8.2 包接型1細胞アレイチップ 140 |
| 8.3 包接型チップの作製 141 |
| 8.4 包接型チップの温度特性 142 |
| 8.5 リンパ球のアレイ化 145 |
| 8.6 おわりに 146 |
| 9. PDMSを利用したスフェロイドアレイ化技術（中澤浩二） 147 |
| 9.1 はじめに 147 |
| 9.2 細胞のパターニングと2D/3D細胞培養技術 148 |
| 9.3 PDMSの特徴とセルチップへの展開 149 |
| 9.4 マイクロコンタクトプリンティング法を利用したスフェロイドアレイ化技術 149 |
| 9.5 微細構造PDMS基板を用いたスフェロイドアレイ化技術 152 |
| 9.6 おわりに 153 |
| 10. 細胞外マトリックスを用いたマイクロパターン細胞共培養（福田淳二，鈴木博章） 156 |
| 10.1 はじめに 156 |
| 10.2 マイクロパターン細胞共培養 157 |
| 10.3 細胞外マトリックスを用いたマイクロパターン細胞共培養 157 |
| 10.4 おわりに 162 |
| 第4章 細胞の3D組織化 |
| 1. 皮膚の3次元培養キット（濵島史泰） 164 |
| 1.1 はじめに 164 |
| 1.2 動物実験代替法と培養皮膚モデル 164 |
| 1.3 ヒト3次元培養表皮モデルLabCyte EPI-MODEL 165 |
| 1.4 美白研究と培養皮膚モデル 167 |
| 1.5 LabCyte MELANO-MODEL 170 |
| 1.6 おわりに 172 |
| 2. 生体内環境モデルとなる培養担体の開発（竹澤俊明） 174 |
| 2.1 はじめに 174 |
| 2.2 生体内の細胞挙動を制御している環境 175 |
| 2.3 生体外に於いて生体内の疑似環境を創出する構想 175 |
| 2.4 組織を薄切した切片担体の開発とその担体を用いた細胞応答の解析 176 |
| 2.5 コラーゲンビトリゲル薄膜担体の開発とその担体を用いた細胞応答の解析 179 |
| 2.6 おわりに 180 |
| 3. PuraMatrix（TM）ハイドロゲル：in vitroでの3次元組織再構築のためのペプチド性合成ECM（武井次郎） 182 |
| 3.1 代替法の必要性 182 |
| 3.2 3次元培養の重要性 182 |
| 3.3 PuraMatrix（TM） 183 |
| 3.4 In vitro代替法につながる技術 184 |
| 3.5 その他のトピック 187 |
| 4. 新規ハイドロゲル（メビオールジェル（R））を用いた三次元培養（吉岡浩） 189 |
| 4.1 はじめに 189 |
| 4.2 メビオールジェル（R）の特徴 189 |
| 4.3 メビオールジェル（R）を用いた細胞培養法 191 |
| 4.4 肝細胞の三次元培養によるHCV産生 192 |
| 5. コラーゲンゲルドロップ三次元培養法を利用した抗癌剤スクリーニングシステム―抗癌剤感受性試験の実績と動物実験代替法としての可能性―（小林昶運） 196 |
| 5.1 はじめに 196 |
| 5.2 CD-DST法の概要 197 |
| 5.3 CD-DSTの流れ 197 |
| 5.4 臨床治療の指標としての応用 198 |
| 5.5 動物実験代替法としての応用 199 |
| 5.6 これからの可能性 200 |
| 6. インクジェット技術を応用した細胞の3次元パターニング（逸見千寿香，西山勇一，中村真人） 203 |
| 6.1 はじめに 203 |
| 6.2 インクジェット技術の応用に期待される利点 204 |
| 6.3 インクジェット技術による細胞プリンティング 205 |
| 6.3.1 インクジェットノズルを用いた細胞の打ち出し実験 205 |
| 6.3.2 ゲル材料を用いた細胞のパターニング 205 |
| 6.3.3 3Dバイオプリンターの試作，及び細胞の3次元パターニング 206 |
| 6.4 今後の展望 207 |
| 6.4.1 その他のゲル材料の応用 207 |
| 6.4.2 インクジェット技術によるその他の生物材料のパターニングと3次元造形への応用 208 |
| 6.5 おわりに 208 |
| 7. 集積化マイクロ灌流培養デバイスによる臓器由来細胞の培養と計測（木村啓志，酒井康行，藤井輝夫） 210 |
| 7.1 はじめに 210 |
| 7.2 マイクロ灌流培養デバイス 210 |
| 7.3 マイクロ灌流培養デバイスの応用例 212 |
| 7.3.1 肝臓組織構築のための灌流培養デバイス 212 |
| 7.3.2 半透膜を有する灌流培養デバイス 213 |
| 7.3.3 機能集積化マイクロ灌流培養デバイス 215 |
| 7.4 おわりに 219 |
| 8. 動物実験代替のためのバイオリアクターを用いた3次元組織培養（加藤竜司，本多裕之） 221 |
| 8.1 はじめに 221 |
| 8.2 バイオリアクターを用いた細胞培養 221 |
| 8.3 バイオリアクターを用いた細胞培養の可能性 222 |
| 8.4 ラジアルフロー型バイオリアクター（Radial-flow Bioreactor：RFB）とは 223 |
| 8.5 ラジアルフロー型バイオリアクターの構造と特徴 224 |
| 8.6 ラジアルフロー型バイオリアクターにおける細胞培養 228 |
| 8.7 ラジアルフロー型バイオリアクターを用いた人工癌組織の構築 229 |
| 8.8 おわりに 232 |
| 第5章 細胞応答のセンシング・イメージング |
| 1. 甲虫ルシフェラーゼを利用したリアルタイム・マルチカラー遺伝子発現計測（浅井友実，西井重明，近江谷克裕） 235 |
| 1.1 生物発光システムの利用 235 |
| 1.2 遺伝子発現解析に用いられるルシフェラーゼ 236 |
| 1.3 遺伝子発現解析のためのレポータープラスミドの構築 237 |
| 1.4 リアルタイム測定 238 |
| 1.5 発光イメージング 238 |
| 1.6 マルチカラー発光計測 240 |
| 1.7 おわりに 242 |
| 2. p53R2遺伝子発現を指標としたヒト細胞遺伝毒性試験法（大野克利，山田敏広） 244 |
| 2.1 はじめに 244 |
| 2.2 DNA修復遺伝子p53R2 244 |
| 2.3 試験方法 245 |
| 2.4 遺伝毒性物質の検出と既存の遺伝毒性試験との比較 246 |
| 2.5 DNA損傷形式の異なる遺伝毒性物質の反応性 246 |
| 2.6 各細胞による反応性の差 248 |
| 2.7 おわりに 249 |
| 3. 細胞マイクロアレイチップのための計測・支援技術（鈴木正康） 252 |
| 3.1 動物実験代替法としての細胞マイクロアレイチップ 252 |
| 3.2 細胞マイクロアレイチップに必要なセンサ技術 253 |
| 3.2.1 細胞活性の検出 253 |
| 3.2.2 細胞の特定生成物の検出 253 |
| 3.2.3 細胞内部の状態の計測 254 |
| 3.3 マイクロアレイ型化学・バイオセンサ 254 |
| 3.4 二次元SPRアフィニティーセンサ 256 |
| 3.5 単一細胞スクリーニングシステム実現のための関連支援技術 258 |
| 3.5.1 特定細胞回収 258 |
| 3.5.2 一体型細胞スクリーニング装置 259 |
| 3.6 終わりに 259 |
| 4. 血管新生キット―細胞培養と解析ソフトウェア―（半田由希，元野満，鳥島久） 262 |
| 4.1 はじめに 262 |
| 4.2 血管新生キットの原理・特長 263 |
| 4.2.1 構造 263 |
| 4.2.2 操作 263 |
| 4.3 プロトコール 264 |
| 4.3.1 キットの培養 264 |
| 4.3.2 スコアリング 264 |
| 4.4 陽性対照と陰性対照の血管新生データ 266 |
| 4.4.1 陽性対照 266 |
| 4.4.2 陰性対照 266 |
| 4.5 応用例 266 |
| 4.6 おわりに 267 |
| 5. マイクロ電極を用いた受精卵呼吸測定（阿部宏之） 269 |
| 5.1 はじめに 269 |
| 5.2 マイクロ電極を用いた細胞呼吸測定装置 269 |
| 5.3 受精卵の呼吸測定 271 |
| 5.4 呼吸活性を指標にした胚のクオリティー評価 273 |
| 5.5 細胞呼吸測定装置の応用 274 |
| 5.6 おわりに 275 |
| 6. 組織モデルを指向した細胞ネットワークチップ（梶弘和，西澤松彦） 277 |
| 6.1 はじめに 277 |
| 6.2 パターン培養技術 277 |
| 6.2.1 マイクロコンタクトプリンティング 277 |
| 6.2.2 電気化学反応を利用するダイナミックパターニング 278 |
| 6.3 細胞マイクロパターンのキャラクタリゼーション 280 |
| 6.3.1 心筋細胞ネットワークの拍動特性と薬理応答の基礎検討 280 |
| 6.3.2 毛細血管構造のパターン形成と機能評価 282 |
| 6.3.3 ヘテロな細胞間相互作用による肝細胞の機能発現 282 |
| 6.4 おわりに 283 |
| 7. 薬物細胞アッセイと細胞スクリーニング技術（森田資隆） 286 |
| 7.1 はじめに 286 |
| 7.2 細胞チップを用いた神経成長因子様作用ペプチドのスクリーニング 287 |
| 7.3 ファージディスプレイ法による幹細胞認識化合物のスクリーニング 290 |
| 7.4 おわりに 293 |
| 8. 代謝デバイスの構築と応用―バイオ人工肝からマイクロリアクター，そしてナノテクの世界へ―（大政健史，絵野沢伸） 295 |
| 8.1 はじめに 295 |
| 8.1.1 生体内代謝反応のシミュレートとは 295 |
| 8.1.2 生体内代謝の重要な担い手―肝臓 295 |
| 8.2 代謝デバイスの構築とそのセンシングへの応用 296 |
| 8.2.1 マクロ（個体）からのアプローチ：動物実験系，バイオ人工臓器 297 |
| 8.2.2 ミクロ（酵素，細胞）からのアプローチ：肝ミクロソーム，初代肝細胞，肝由来細胞株の利用 297 |
| 8.2.3 マイクロリアクターを用いた連続代謝デバイス 297 |
| 8.2.4 ナノテクノロジーを用いた非細胞性代謝デバイスの開発 299 |
| 8.3 おわりに 300 |
| 9. 蛍光相関分光法による細胞内ならびに生体内シグナル解析（齋藤有香，金城政孝） 302 |
| 9.1 はじめに 302 |
| 9.2 目的 302 |
| 9.3 方法 303 |
| 9.3.1 蛍光相関分光法 303 |
| 9.3.2 灌流法 305 |
| 9.3.3 灌流条件 306 |
| 9.3.4 灌流肝のFCS測定 307 |
| 9.4 蛍光カルシウムインジケーターRhod2-AMについて 308 |
| 9.5 実験結果 308 |
| 9.5.1 Rhod2が細胞内で機能しているかの検討 308 |
| 9.5.2 Rhod2溶液中，遊離肝細胞，灌流肝でのFCS測定結果の比較 310 |
| 9.5.3 2mM，20mM乳酸添加時のFCS測定結果の比較 311 |
| 9.6 考察 313 |
| 9.7 展望 313 |
| 10. 非線形光学顕微鏡による細胞・生体組織のイメージング（藤田克昌） 315 |
| 10.1 はじめに―生体をありのままで観察― 315 |
| 10.2 2光子励起蛍光顕微鏡 315 |
| 10.3 第2高調波顕微鏡 319 |
| 10.4 コヒーレントアンチストークスラマン散乱顕微鏡 321 |
| 第1章 代替法における工学的新技術の可能性 |
| 1. 代替法国際動向から見た新技術導入の可能性（小島肇夫） 1 |
| 1.1 動物実験代替法における新技術導入の目的 1 |
| 1.2 試験法の公定化 1 |
| 1.3 バリデーション 2 |
| 1.3.1 動物実験代替法センターの設立 2 |
