第1章 DNAの分離と精製 1 |
1・1 DNAの取扱い 田村隆明 1 |
1・2 DNAの精製 青木務,田村隆明 4 |
1・2・1 タンパク質の除去 4 |
1・2・2 低分子の除去・脱塩 7 |
A. 陰イオン交換樹脂を用いた低分子の除去 |
B. ゲルろ過による低分子の除去・脱塩 |
1・2・3 RNAの除去 9 |
A. 塩化リチウムによるRNAの除去 |
B. RNase AによるRNAの除去 |
C. 塩化セシウム密度勾配遠心法 |
1・3 DNAの濃縮 小西慶幸,田村隆明 12 |
A. エタノール沈殿法 |
B. イソプロパノール沈殿法 |
C. プタノール濃縮法 |
D. ポリエチレングリコール(PEG)沈殿法 |
1・4 DNAの電気泳動 田村隆明 17 |
1・4・1 DNAのサイズで分離する電気泳動 17 |
A. アガロースゲル電気泳動 |
B. ポリアクリルアミドゲル電気泳動 |
C. ゲルからのDNA回収法 |
D. パルスフィールドゲル電気泳動 |
1・4・2 DNA高次構造を解析する電気泳動 23 |
A. メチル化DNAの解析 |
B. 超らせんの解析 |
C. 複製フォークの解析 |
1・5 DNAの検出と定量 高橋由明,木南凌 28 |
1・5・1 分光法 28 |
1・5・2 染色法 28 |
第2章 ゲノムDNAの分離と精製 33 |
2・1 真核細胞のゲノムDNA 33 |
2・1・1 動物ゲノムDNAの調製 高橋由明,木南凌 34 |
2・1・2 植物ゲノムDNAの調製 上口智治 37 |
2・1・3 線虫ゲノムDNAの調製 高橋由明,木南凌 39 |
2・1・4 酵母ゲノムDNAの調製 高橋由明,木南凌 42 |
2・1・5 細胞小器官DNAの調製 高橋由明,木南凌 46 |
2・2 原核細胞のゲノムDNA 上口智治 50 |
2・3 ウイルスのゲノムDNA 斎藤泉,高橋由明,木南凌 51 |
2・3・1 アデノウイルスDNA 51 |
2・3・2 ワクシニアウイルスDNA 54 |
第3章 RNAの分離と精製 横川隆志,西川一八 57 |
3・1 RNAの取扱い一般に関する注意 57 |
3・2 RNAの分離 59 |
3・2・1 RNAの分離一般 59 |
A. 酸性フェノール法 |
B. グアニジンチオシアネート法 |
C. RNA抽出キット |
3・2・2各種RNAの分離 61 |
A. mRNA |
B. rRNA |
C. tRNA |
D. その他の低分子RNA |
E. 組織特異的なRNA |
3・3 RNAの精製 64 |
3・3・1 タンパク質の除去 64 |
3・3・2 脱塩と簡易精製 66 |
A. DEAEセルロースカラムクロマトグラフィー |
B. ゲルろ過カラムクロマトグラフィー |
3・3・3 塩基特異的RNAの精製 69 |
A. mRNA(ポリ(A)RNA)の濃縮 |
B. 固相化プローブ法 |
3・4 RNAの濃縮 72 |
A. アルコール沈殿法 |
B. 透析 |
3・5 RNAの電気泳動 75 |
A. ポリアクリルアミドゲル電気泳動 |
B. アガロースゲル電気泳動 |
C. ゲルからのRNA回収法 |
3・6 RNAの検出と定量 81 |
3・7 in vitro転写系を用いたRNAの大量調製 84 |
3・7・1 T7 RNAポリメラーゼによる転写のための鋳型の調整法 85 |
3・7・2 転写用酵素の調製 88 |
3・7・3 転写反応 90 |
第4章 プラスミドDNAの調製 升方久夫 93 |
4・1 プラスミドの基礎知識 93 |
4・2 大腸菌へのプラスミドの導入 98 |
A. DMSO法 |
B. エレクトロボレーション法 |
C. プラスミド保持菌の培養と保存 |
4・3 大腸菌プラスミドDNAの調製 102 |
第5章 ファージの調製とDNAの抽出 升方久夫 109 |
5・1 ファージの基礎知識 109 |
5・2 λファージの調製 112 |
5・3 λファージの濃縮 114 |
5・4 λファージの精製 115 |
5・5 λファージDNAの抽出 116 |
第6章 核酸の検出と定量 119 |
6・1 ヌクレオチド,ヌクレオシドの検出および定量 鈴木勉 120 |
6・1・1 吸光光度計による定量 120 |
6・1・2 薄層クロマトグラフィー 122 |
6・1・3 高速液体クロマトグラフィー法 125 |
6・2 ゲノムのGC含量の推定 横田明 128 |
A. 超遠心法 |
B. 融解温度法 |
C. 高速液体クロマトグラフィー法 |
第7章 遺伝子操作のための各種酵素の利用法 青山卓史 133 |
7・1 制限酵素 134 |
7・2 DNA合成酵素 137 |
A. T4 DNAポリメラーゼおよびクレノウ酵素 |
B. 耐熱菌由来DNAポリメラーゼ |
C. 逆転写酵素 |
D. ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ |
7・3 DNA分解酵素 142 |
A. エキソヌクレアーゼ |
B. エンドヌクレアーゼ |
7・4 DNAリガーゼ 144 |
7・5 ポリヌクレオチドキナーゼおよびアルカリホスファターゼ 145 |
第8章 DNA塩基配列の解析 149 |
8・1 DNA塩基配列決定の戦略 笠原康裕,小笠原直毅 149 |
8・1・1 ショットガン法 149 |
8・1・2 デリーションミュータント法 154 |
8・1・3 プライマーウォーキング法 156 |
8・2 DNA塩基配列決定法 笠原康裕,小笠原直毅 157 |
A. ジデオキシ法 |
B. マクサム・ギルバート法 |
C. シークエンスゲルの作製法と泳動条件 |
8・3 自動シークエンサー 森浩禎,北川正成,荒武 163 |
8・4 コンピューターによるゲノムデータの解析 森浩禎,北川正成,荒武 166 |
第9章 RNA塩基配列の解析 175 |
9・1 逆転写酵素を用いたRNAの塩基配列決定法(ジデオキシ法) 菊池洋 175 |
9・2 RNAの標識法と末端構造の解析 菊池洋 177 |
9・3 ドニス・ケラー法によるRNAの塩基配列解析 菊池洋 182 |
9・4 ホルムアミド分解法によるRNAの塩基配列解析 菊池洋 186 |
9・5 RNAの二次構造の解析 菊池洋,大槻高史 190 |
A. コンピューターによるRNAの二次構造解析 |
B. 酵素による二次構造マッピング |
C. 化学試薬による二次構造マッピング |
第10章 核酸の化学合成法 関根光雄 197 |
10・1 DNAの化学合成 197 |
10・1・1 DNA合成の原理 197 |
10・1・2 DNA合成の実際 200 |
10・1・3 自動合成機の利用 206 |
10・1・4 合成DNAの外注 206 |
10・2 RNAの化学合成 207 |
10・2・1 RNA合成の原理 207 |
10・2・2 RNA合成の実際 209 |
索引 213 |
第1章 ハイブリダイゼーションによるゲノムとDNAとRNAの解析法 1 |
1.1 サザンハイブリダイゼーション 横堀 伸一 1 |
1.2 ノーザンハイブリダイゼーション 横堀 伸一 13 |
1.3 プラーク/コロニーハイブリダイゼーション 横堀 伸一 16 |
1.4 蛍光 in situハイブリダイゼーション(FISH) 志賀 靖弘 21 |
1.5 プローブの標識と選択 横堀 伸一 26 |
第2章 ライブラリーの作製とクローニング 野島 博 31 |
2.1 cDNAライブラリーの作製 31 |
2.2 ゲノムライブラリーの作製 44 |
2.3 スクリーニング 49 |
2.4 サブクローニング 58 |
第3章 PCRの活用法 久木田洋児, 林 健志 65 |
3.1 PCRの原理 65 |
3.2 PCRのための準備 67 |
3.3 PCRの基本手順 69 |
3.4 応用的PCR TAクローニング/RT-PCR法/RACE法/degenerate-PCR法/PCR-SSCP法 71 |
第4章 遺伝子機能解析のアラカルト 83 |
4.1 遺伝子とタンパク質の相互作用 83 |
4.1.1 タンパク質-核酸結合実験に用いる材料の調製法 今川 正良 84 |
4.1.2 ゲルシフト法 今川 正良 92 |
4.1.3 フットプリント法 今川 正良 96 |
4.1.4 UVによる架橋法 平尾 一郎 102 |
4.2 転写開始点などの解析 酒井 正春 104 |
4.2.1 S1マッピング法 105 |
4.2.2 RNasaプロテクション(マッピング)法 109 |
4.2.3 プライマー伸長法 111 |
4.3 プロモーターアッセイ 今川 正良 114 |
4.4 遺伝子への人工変異の導入 平尾 一郎 118 |
4.5 ディファレンシャルディスプレー法による遺伝子検索 田口 精一 125 |
4.6 DNAチップによるゲノムの総合解析 田口 精一 129 |
4.7 リポザイムやアンチセンスRNAの利用 黒崎直子, 田村 裕, 高久 洋 133 |
第5章 遺伝子導入による遺伝子機能解析 139 |
5.1 細胞への遺伝子導入と解析 中平健祐,岩崎靖乃 139 |
5.1.1 トランスフェクション法の種類とその選択 139 |
5.1.2 トランスフェクション法の実際 リン酸カルシウム法/リポフェクション法 143 |
5.2 トランスジェニックマウスの作製 鹿川 哲史 149 |
5.3 遺伝子破壊-ノックアウトマウスの作製 三宝 誠, 三宝千秋, 八木 健 157 |
5.4 レトロウイルスを用いた遺伝子導入 池中 一裕 192 |
索引 197 |