| 「生物化学実験法」シリーズ企画の趣旨 |
| 緒言 ⅲ |
| 1.腸管の機能とは ⅲ |
| 2.腸管機能と食品機能 ⅳ |
| 3.腸管と免疫 ⅴ |
| 4.本書の目的 ⅵ |
| Ⅰ.腸管細胞形態観察法 1 |
| Ⅰ-1 腸管の分離(マウスの解剖) 3 |
| a)用意する解剖器具，試薬 3 |
| b)マウスの屠殺 4 |
| c)腹部切開 5 |
| d)腸の摘出 5 |
| e)摘出した腸管の処理 6 |
| Ⅰ-2 光学顕微鏡による観察 7 |
| a）パラフィン切片 8 |
| b)凍結切片 8 |
| c）Whole mount標本 8 |
| d）スライドガラスの処理 9 |
| Ⅰ-2-3 免疫組織化学 9 |
| Ⅰ-2-4 免疫組織化学に用いる抗血清と免疫反応の特異性のチェック 9 |
| Ⅰ-2-5 染色の具体例 11 |
| a)上皮細胞 11 |
| b)免疫系の細胞 11 |
| c)神経系 12 |
| Ⅰ-2-6 In situハイプリダイゼーション法 12 |
| a)標識プローブの調製 13 |
| b)ハイプリダイゼーション 13 |
| c)特異性のチェック 14 |
| Ⅰ-3 電子顕微鏡による観察法 15 |
| Ⅰ-3-1 固定 15 |
| Ⅰ-3-2 走査型電顕試料作製法 15 |
| a)固定 15 |
| b)導電染色 16 |
| c)脱水 16 |
| d)乾燥 16 |
| e)金属コーティング 17 |
| f)簡単で便利な標本作製法 17 |
| Ⅰ-3-3 透過型電顕試料作製法 18 |
| a)固定・脱水・包埋・染色 18 |
| b)培養細胞の処理 19 |
| c)免疫電顕法 19 |
| 文献 21 |
| Ⅱ.消化吸収細胞実験法 23 |
| Ⅱ-1 上皮組織と細胞の分離 25 |
| Ⅱ-1-1 刷子縁膜小胞調製法 25 |
| Ⅱ-1-2 小腸上皮細胞の初代培養 30 |
| a)準備 31 |
| b)方法 31 |
| c)まとめ 34 |
| Ⅱ-1-3 株化細胞(上皮細胞) 35 |
| a)小腸上皮細胞のモデルとして用いられる株化細胞 35 |
| b)株化細胞の取り扱い法 37 |
| Ⅱ-2 測化吸収機能の実験 41 |
| Ⅱ-2-1 酵素機能実験法 41 |
| a)食品成分(基質)の消化・吸収性の評価 41 |
| b)絨毛軸にそった酵素発現測定法 46 |
| Ⅱ-2-2 トランスポーター機能測定法 49 |
| a)小腸上皮細胞に発現するトランスポーター 49 |
| b)小腸上皮トランスポーターの制御・調節 50 |
| c)小腸上皮トランスポーターの活性測定法 51 |
| Ⅱ-2-3 イオンチャネル・起電性トランスポータ一機能測定法 54 |
| a)はじめに 54 |
| b)電気生理学的研究法とは 55 |
| c)短絡電流法 56 |
| d)パッチクランプ法 61 |
| Ⅱ-2-4 結合蛋白質機能測定法 65 |
| a)腸管細胞における消化吸収に関わる結合蛋白質の種類と役割 65 |
| b)脂肪酸結合蛋白質機能測定法 66 |
| Ⅱ-2-5 トランスサイトーシス機能測定法 73 |
| a)トランスサイトーシスとは 73 |
| b)トランスサイトーシス機能測定に用いる腸管上皮細胞層の調製法 75 |
| c)トランスサイトーシス機能の測定 76 |
| Ⅱ-3 上皮細胞機能の実験法 80 |
| Ⅱ-3-1 上皮細胞層のバリアー機能測定法 80 |
| a)腸管上皮細胞層のバリアー機能 80 |
| b)TERと物質透過量の測定法 82 |
| Ⅱ-3-2 腸管内分泌細胞機能測定 85 |
| a)表面灌流法(prifusion)用いたラット小腸上皮の分散細胞からのコレシストキニン(CCK)分泌 86 |
| b)コレシストキニン(CCK)産生細胞株STC-1における細胞内カルシウム濃度変化の測定 88 |
| Ⅱ-3-3 複合培養系による上皮細胞機能測定 96 |
| a)複合培養系の概念 96 |
| b)小腸上皮細胞を用いた複合培養系 97 |
| c)小腸上皮様モデル細胞Caco-2と神経系細胞PC12の複合培養研究例 97 |
| 文献 101 |
| Ⅲ.腸管免疫細胞実験法 107 |
| Ⅲ-1 抗原投与法 109 |
| Ⅲ-1-1 経口投与 109 |
| a)自由摂取 110 |
| b)強制投与 111 |
| Ⅲ-1-2 腹腔内，皮下，静脈内，皮内 112 |
| a)腹腔内投与 112 |
| b)皮下投与 114 |
| c)静脈内投与 116 |
| d)皮内投与 118 |
| Ⅲ-2 実験動物 119 |
| Ⅲ-2-1 TCR(T細胞抗原レセプター)トランスジェニックマウス 119 |
| a)腸管免疫系T細胞の応答性の解析 120 |
| b)経口免疫寛容の解析 121 |
| c)TCRトランスジェニックマウス由来T細胞の細胞移入系 123 |
| d)対立遺伝子排除の不完全とRAG-/-TCRトランスジェニックマウスの利用 125 |
| Ⅲ-2-2 無菌動物 126 |
| a)アイソレーターの構造・部品 126 |
| b)無菌動物の作出 126 |
| c)無菌動物の飼育 127 |
| d)無菌検査 129 |
| e)動物への投与 129 |
| f)細胞調製 130 |
| Ⅲ-2-3 食品アレルギーモデルマウス 131 |
| Ⅲ-2-4 その他の病態モデル動物 137 |
| a)ヒト炎症性腸疾患と腸管免疫系の関係 137 |
| b)腸炎モデル動物の種類 138 |
| c)腸炎モデル動物における病態，病因の解析およびその成果 139 |
| d)腸炎モデルにおいて進展の期待される点 142 |
| Ⅲ-3 細胞の分離 144 |
| Ⅲ-3-1 腸管免疫細胞分離法 144 |
| a)パイエル板細胞の調製 144 |
| b)マウス小腸上皮内リンパ球(IEL)の調製法 149 |
| c)粘膜固有層リンパ球の調製法 154 |
| d)クリプトパッチ細胞調製法 161 |
| Ⅲ-3-2 脾臓・リンパ節細胞の調製法 166 |
| a)脾臓細胞調製法 167 |
| b)リンパ節細胞調製法 170 |
| Ⅲ-3-3 細胞画分のフローサイトメーター，磁気ビーズを用いた分画法 173 |
| a)T細胞 173 |
| b)B細胞 180 |
| c)樹状細胞 184 |
| Ⅲ-4 腸管免疫機能の実験 189 |
| Ⅲ-4-1 経口免疫寛容実験法 189 |
| a)概論 189 |
| b)経口免疫寛容の誘導と解析 190 |
| c)T細胞抗原レセプタートランスジェニックマウス(TCRトランスジェニックマウス) 193 |
| d)細胞移入系 195 |
| Ⅲ-4-2 抗体産生機能実験 196 |
| a)ELISA法 196 |
| b)ELISPOT法 198 |
| Ⅲ-5 細胞機能の実験法 202 |
| Ⅲ-5-1 細胞増殖活性 202 |
| a)細胞増殖の誘導 202 |
| b)増殖活性評価法 206 |
| Ⅲ-5-2 細胞表面マーカーの解析 211 |
| a)マウスIELに対する4カラーFACS解析 213 |
| Ⅲ-5-3 サイトカインの定量 216 |
| a)サイトカインの測定方法 217 |
| b)ELISA法 217 |
| c)バイオアッセイ 220 |
| d)ELISPOT法 221 |
| e)細胞内サイトカイン染色 222 |
| f)定量的PCR法 222 |
| Ⅲ-5-4 抗原提示機能 223 |
| a)抗原提示とは 223 |
| b)方法 229 |
| c)まとめ 229 |
| Ⅲ-5-5 アポトーシスの検出法 229 |
| a)免疫系におけるアポトーシスの役割 229 |
| b)アポトーシス細胞の特徴 230 |
| c)アポトーシスの検出 230 |
| Ⅲ-5-6 細胞内シグナル伝達 237 |
| Ⅲ-5-7 細胞間で発現の異なる遺伝子の解析 243 |
| a)ディファレンシャルディスプレイ法 243 |
| b)Subtractive hybridization法 249 |
| Ⅲ-5-8 蛋白質発現の解析 257 |
| a)二次元電気泳動 257 |
| b)銀染色 261 |
| c)ペプチドマスフィンガープリント法 262 |
| 文献 266 |
| 索引 269 |
