I ポストゲノム時代の研究戦略 (宮崎 香) 1 |
II 細胞実験法 5 |
II.A 基礎知識 6 |
II.A.1 器官,組織,細胞 (堀内義史・矢野和雄) 6 |
a. 個体の成熟 6 |
b. 組織と細胞 6 |
c. 細胞の種類 11 |
d, 用語の説明 15 |
II.A.2 分泌性生理活性物質 (矢野和雄・堀内義史) 18 |
a. サイトカイン 18 |
b. サイトカイン以外の生理活性物質 26 |
c. 細胞外マトリックス分子 28 |
II.A.3 細胞分化 : 表皮角化細胞を例として (戸田年総) 29 |
a. 細胞分化の生物学的意味 29 |
b. 組織内における表皮角化細胞の分化 30 |
c. 培養条件下における表皮角化細胞の増殖と分化 32 |
II.A.4 アポトーシス (田沼靖一) 33 |
a. アポトーシスの概念 33 |
b. アポトーシスの生理的意味 34 |
c. アポトーシスの基本的メカニズム 36 |
II.A.5 細胞の老化,不死化,および癌化 (宮崎 香) 38 |
a. 細胞の老化と不死化 38 |
b. 細胞の癌化 39 |
c. 癌細胞の特徴 41 |
II.A.6 癌の種類,転移および脳瘍血管新生 (宮崎 香) 42 |
a. 腫瘍の種類と分類 43 |
b. 癌の転移 44 |
c. 腫瘍血管新生 46 |
II.B 基本的な細胞培養技術 48 |
II.B.1 基本設備 (長尾嘉信) 48 |
a. 培養室とその内部設備 48 |
II.B.2 培養器具およびその洗浄と滅菌 (長尾嘉信) 51 |
II.B.3 培養液と試薬の調製 (矢野和雄・堀内義史) 53 |
a. 培養液の調製 53 |
b. 平衡塩類溶液 : 生理的塩類溶液の調製 58 |
c. 試薬の調製 59 |
d. 試薬および試料の添加法 60 |
e. 試薬の取り扱い方の具体例 63 |
f. 細胞培養に使用される試薬 63 |
II.B.4 培養細胞の分散法と細胞数の計測 (安光英太郎) 64 |
a. 細胞の分散法 64 |
b. 血球計算板による細胞数の計測 65 |
c. 自動細胞計数機を用いる細胞数の測定 67 |
II.B.5 細胞のまきこみ (矢野和雄・堀内義史) 70 |
II.B.6 無血清培養法 (宮崎 香) 74 |
a. 無血清培養のための実験条件 75 |
b. 市販無血清培地 78 |
II.B.7 ゲル培養法 (矢野和雄・堀内義史) 78 |
a. 軟寒天ゲル培養法 79 |
b. メチルセルロースゲル培養法 81 |
c. コラーゲンゲル培養法 82 |
II.B.8 クローン化 (西川克三) 87 |
a. クローン化の必要性 87 |
b. 一般的基本操作 87 |
II.B.9 細胞の凍結保存 (宮崎 香) 88 |
II.B.10 マイコプラズマの予防・検定・駆除 (竹内郁登) 91 |
a. マイコプラズマとは 91 |
b. マイコプラズマの予防 91 |
c. マイコプラズマの検定 91 |
d. マイコプラズマの駆除 92 |
II.B.11 細胞の入手法 (宮崎 香) 93 |
a. 国内で利用できる細胞バンク 93 |
b. 市販の正常細胞 94 |
c. 細胞の輸送と輸送後の取り扱い 95 |
II.C. 初代培養法 96 |
II.C.1 表皮細胞 (松本邦夫) 96 |
a. ケラチノサイトの無血清培養法 96 |
b. 培養ケラチノサイトの特性 100 |
c. 培養細胞を使った実験例 101 |
II.C.2 線維芽細胞 (宮崎 香・松本邦夫) 103 |
a. マウス胎児線維芽細胞の培養法 103 |
b. ヒト皮膚正常線維芽細胞の培養法 105 |
II.C.3 ヒト血管内皮細胞 (船橋泰博) 107 |
a. ヒト臍帯静脈からの酵素法による内皮細胞の調製 107 |
b. HUVEC の継代 109 |
c. HUVEC の応用例 111 |
d. 市販ヒト内皮細胞 111 |
II.C.4 コラーゲンゲルを用いる血管新生モデル (若林利明) 111 |
a. 血管内皮細胞増殖モデル 111 |
b. 血管内皮細胞遊送モデル 112 |
c. 管腔形成モデル 112 |
d. 大動脈3次元培養モデル 112 |
II.C.5 ラット血管平滑筋細胞 (野本研一・伊藤昌史) 114 |
a. 酵素法を用いた血管平滑筋細胞単離の実際 115 |
b. 培養平滑筋細胞の特徴 117 |
c. 入手可能なヒト由来血管平滑筋細胞 118 |
II.C.6 中枢神経細胞 (西尾チカ・畠中 寛) 118 |
II.C.7 末梢神経細胞 (堀江秀典) 122 |
II.C.8 巨核球 (矢野和雄・堀内義史) 125 |
a. 巨核球と血小板産生 125 |
II.C.9 癌細胞 (宮崎 香) 130 |
II.D 培養細胞を用いた実験法 134 |
II.D.1 細胞の形態観察と記録 (西 望) 134 |
a. 固定 134 |
b. 浮遊細胞の固定 135 |
c. 染色 135 |
II.D.2 細胞数の変化と測定 (安光英太郎・宮崎 香) 138 |
a. 増殖曲線の作成法 139 |
b. 細胞核数の測定 140 |
c. 色素還元反応を利用した相対細胞量の測定(MTT法) 141 |
d. コロニー形成率の測定 143 |
II.D.3 DNA合成の測定 (西 望) 144 |
a. DNA合成の測定における一般的な検討事項 145 |
b. DNA合成活性の測定 147 |
c. Labering index の測定 150 |
II.D.4 アポトーシスの検定 (田沼靖一) 154 |
a. 細胞死の判定法 154 |
b. 顕微鏡によるアポトーシスの観察 159 |
c. DNA断片化の検出法 162 |
d. TUNEL法 163 |
II.D.5 培養細胞が分泌する生理活性物質の調製 (宮崎 香) 167 |
II.D.6 細胞接着の測定 (宮崎 香) 169 |
II.D.7 細胞運動能の測定 (廣崎智巳・宮崎 香) 171 |
a. ボイデンチャンバー法によるケモタキシスの測定 172 |
b. ケモカイネシスの測定法 173 |
c. その他 173 |
II.D.8 培養細胞を用いた環境ホルモンの測定 (中村隆範・東海林博樹) 174 |
a. 環境ホルモンとは 174 |
b. 内分泌撹乱物質(環境ホルモン)の作用機序 174 |
c. 内分泌撹乱物質の検定法の種類と特徴 175 |
d. 実験例 : E-スクリーン試験 176 |
II.D.9 レセプターの分析 (松本邦夫) 178 |
a. Scatchard 解析 179 |
b. アフィニティクロスリンク法 183 |
c. レセプターチロシンリン酸化の解析 185 |
II.D.10 フローサイドメトリーによる分析 187 |
A. DNA (長尾嘉信) 187 |
a. フローサイトメトリーの概念 187 |
b. 試料細胞の調製 188 |
c. 標準試料 188 |
d. DNAヒストグラムおよびスキャッターグラム 189 |
e. ヒストグラムの解析 189 |
f. 細胞のソーティング 191 |
B. 細胞表面蛋白質 (陰里ゆうみ・宮崎 香) 191 |
II.D.11 細胞抽出液の調製と蛋白質およびDNAの定量 (矢野和雄・堀内義史) 194 |
a. 細胞抽出液の調製 194 |
b. 細胞蛋白質の定量 196 |
c. DNAの定量 198 |
付録 データの処理と実験計画 (矢野和雄・堀内義史) 200 |
(1) 平均と標準偏差 200 |
(2) 標準誤差 201 |
(3) 信頼区間 201 |
(4) 検定 203 |
(5) 相関 205 |
(6) データ処理の実際―組み合わせ数の多いデータ処理について 207 |
(7) 処理法の選択 208 |
(8) パソコンを使ったデータ処理 208 |
III 蛋白質実験法 211 |
III.A 蛋白質の取り扱い 212 |
III.A.1 概論 (細井和雄) 212 |
a. 蛋白質の化学構造 212 |
b. 蛋白質分子間および分子内に働く力 213 |
III.A.2 一般的注意事項 (角野冨三郎) 215 |
a. 実験環境 215 |
b. 溶液の調製についての注意 215 |
c. 定量法の比較 215 |
d. 純度検定法の比較 217 |
e. 蛋白質の安定化に関する注意 218 |
f. 濃縮法の比較 220 |
III.B 蛋白質の抽出法 221 |
III.B.1 概論 (角野冨三郎) 221 |
a. 水溶性蛋白質の抽出 221 |
b. 不溶性蛋白質の抽出 222 |
c. 界面活性剤選択の指標 223 |
d. 界面活性剤の除去法 226 |
III.B.2 CHAPS (田中俊夫) 227 |
a. 性質と特徴 227 |
b. 実施例1 : 核蛋白質の可溶化におけるCHAPSとSB12の比較 227 |
c. 実施例2 : DNA結合蛋白質の抽出と精製 231 |
d. 実施例3 : 増殖因子の安定化 232 |
III.B.3 デオキシコール酸とコール酸 (角野冨三郎・西本行男) 238 |
a. 性質と特徴 238 |
b. 実施例 : ウサギ肝ミクロソーム分画からのシトクロム P-450 LM2の抽出と精製 239 |
III.B.4 ヘプチルチオグルコシド (樋口富彦・吉原 裕) 242 |
a. 性質と特徴 242 |
b. 実施例 : HTGによるSMPからATP合成酵素の抽出 242 |
III.B.5 オクチルグルコシド (西本行男) 244 |
a. 性質と特徴 244 |
b. 実施例:HL-60細胞膜NADPH : NBT還元酵素の可溶化と精製 245 |
III.B.6 Triton X-100 (柏俣正典・細井和雄) 248 |
a. 性質と特徴 248 |
b. 実施例 : 肝細胞膜分画中のEGF受容体の可溶化 249 |
III.B.7 カオトロピックイオン (西 望) 251 |
a. 性質と特徴 251 |
b. 実施例1 : グアニジンチオシアネートによる光合成細菌クロマトフォア膜の可溶化 253 |
c. 実施例2 : ブタ子宮筋から中性プロテアーゼの精製 253 |
III.B.8 尿素とグアニジン (角野冨三郎) 254 |
III.C 二次元電気泳動による蛋白質の分離とWWWデータベースによるマッピング (戸田年総) 256 |
III.C.1 プロテオーム実験法 256 |
a. ポストゲノム時代における蛋白質分析の意義 256 |
b. 蛋白質分析法としてのプロテオーム解析 256 |
c. プロテオーム解析における二次元電気泳動 256 |
III.C.2 プロテオーム解析法 260 |
a. コンピュータ画像解析によるディファレンシャル分析 260 |
b. WWWデータベースによるプロテオームのマッピング 260 |
c. 世界の二次元電気泳動/プロテオームデータベース 263 |
III.D HPLCによる蛋白質の精製 264 |
III.D.1 HPLCシステムの全自動化と初期設定 (樋口富彦) 264 |
a. HPLCシステムの全自動化 264 |
b. フラクションコレクターのディレイサイズの決定 266 |
c. その他 266 |
III.D.2 分子篩HPLC (野々部昌継) 267 |
a. 理論的取り扱い 267 |
b. 分子篩HPLCに用いられる市販の担体と使用法 269 |
III.D.3 イオン交換HPLC (吉原 裕・樋口富彦) 271 |
a. 原理の概説と実際 271 |
b. 溶出に影響する諸因子 272 |
c. 自作HPLCカラムによる分離 273 |
III.D.4 ヒドロキシアパタイトHPLC (吉竹佳乃・西川克三) 274 |
a. 原理と特性 274 |
b. 実施例 : ヒドロキシアパタイトカラムによるマウスモノクローナル抗体の複製 275 |
c. 市販品 275 |
III.D.5 逆相HPLC (樋口富彦・吉原 裕) 277 |
a. 原理と特性 277 |
b. 溶出に影響する諸因子 278 |
III.D.6 疎水HPLC (野々部昌継) 284 |
a. 原理と特性 284 |
b. 実施例 : ヒト血清蛋白質の疎水HPLC 286 |
III.D.7 アフィニティHPLC (甲田誠一) 286 |
a. 原理と特性 286 |
b. 蛋白質の特異的親和性 288 |
c. 実施例 : ヒトC反応蛋白質のホスホリルコリン固定化カラムによる精製 289 |
III.D.8 イムノアフィニティHPLC (岡 治) 289 |
a. 抗原―抗体反応 290 |
b. 原理と特性 290 |
c. 実施例 : モノクローナル抗体カラムによる酵母RNAポリメラーゼIIの精製 291 |
III.E プロテインシーケンサーによるアミノ酸配列決定法 294 |
III.E.1 蛋白質の断片化とペプチドの分離 (吉原 裕) 294 |
a. 蛋白質の断片化 294 |
b. 断片化ペプチドのHPLCによる分離 296 |
c. N末端がブロックされた蛋白質のアミノ酸シーケンス 298 |
d. ブッロッティングした蛋白質のアミノ酸シーケンス 298 |
III.E.2 アミノ酸組成分析 (吉原 裕) 299 |
a. 原理 300 |
b. 試料調製の実際 300 |
c. 解析 302 |
III.E.3 アミノ酸シーケンスの決定法 (吉原 裕) 302 |
a. 原理の概説と分析法 303 |
b. 修復されたアミノ酸 306 |
c. その他 306 |
III.E.4 C末端からのアミノ酸シーケンスの決定法 (高垣洋太郎) 307 |
a. C末端からの化学的逐次分解法 308 |
b. C末端からの酵素的逐次分解法 309 |
c. パーフルオロ酢酸を用いたC末端連続配列分析法 309 |
d. 化学的C末端アミノ酸決定法 309 |
e. C末端ペプチド断片単離法 310 |
III.E.5 質量分析による蛋白質同定法 (岩松明彦) 311 |
a. 原理の概説 311 |
b. 実験方法 312 |
c. 実験例 314 |
III.F 糖蛋白質糖鎖の抽出・精製と糖鎖構造解析法 (近藤昭宏・藤井 茂・三善英知・谷口直之) 316 |
III.F.1 糖鎖構造の簡易分析法 316 |
a. レクチンブロット 316 |
b. レクチンフローサイトメトリー 319 |
III.F.2 糖蛋白質からの糖鎖の遊離と精製 319 |
a. 糖鎖の切断 319 |
b. 糖鎖の精製 321 |
III.F.3 ピリジルアミノ(PA)化による糖鎖の標識と分析および糖鎖調製 322 |
a. PA化の原理 323 |
b. PA化の反応 323 |
c. HPLC分析 324 |
d. 実施例 : PA化法による糖鎖構造の分析と免役グロブリン糖鎖のパターン解析 326 |
III.F.4 NMRによる糖鎖構造決定 331 |
a. 測定の前に 331 |
b. 糖鎖構造決定のための測定の手順 332 |
c. 一次元1H-NMR 333 |
d. 実施例1 : 生成物の構造決定 334 |
d. 実施例2 : 邪魔なHDOシグナルは温度を上げて避ける 335 |
III.G 蛋白質の三次構造解析法 (田中 勲) 339 |
III.G.1 蛋白質の結晶化法 339 |
a. 結晶化をはじめるにあたって 339 |
b. 結晶化ディッシュのセットアップ 341 |
c. 結晶化実験の自動化 342 |
d. 結晶を成長させるには 344 |
III.G.2 X線回折による解析法 345 |
a. 結晶 345 |
b. 回折実験 346 |
c. 構造解析法 349 |
III.G.3 核磁気共鳴法(NMR法)による構造解析 351 |
a. 水素結合情報 351 |
b. 主鎖コンホメーション角φの情報 351 |
c. 原子間距離情報 351 |
IV 抗体を用いる実験法 353 |
IV.A 抗体の基礎知識 (萩原秀昭・宮原順一) 354 |
IV.A.1 抗体の性質 354 |
IV.A.2 抗体の構造 355 |
IV.B 抗体の作成法および一般的取り扱い法 359 |
IV.B.1 抗血清の作製法 (日裏久英・梶田忠宏) 359 |
a. 免役原の調製 359 |
b. 動物への注射法 360 |
c. 抗血清の分離 362 |
IV.B.2 マウスモノクローナル抗体の作製法 (松崎恒一) 363 |
a. 抗原と免役 364 |
b. マウスミエローマ細胞 365 |
c. 細胞融合/HAT選択 365 |
d. スクリーニング 367 |
e. クローニング(限界希釈法) 368 |
f. クラス・サブクラスの決定 369 |
g. 抗体の採取 369 |
IV.B.3 ペプチド抗体 (田中滋康) 370 |
a. 抗原ペプチドの設計 370 |
b. 応用例 371 |
c. ポイント 375 |
IV.B.4 抗体の精製法 (日裏久英・梶田忠宏) 376 |
a. 抗血清からのIgGの非特異的精製法 376 |
b. 抗血清からの抗体の特異的精製法 378 |
c. モノクローナル抗体の精製方法 382 |
d. その他の方法 385 |
e. モノクローナル抗体精製時の注意点 385 |
IV.B.5 抗体の一般的取扱い法 (日裏久英・梶田忠宏) 386 |
a. 抗体蛋白質の定量 386 |
b. 抗体の保存法 386 |
c. 抗体の検定法 386 |
d. 抗体の吸収操作 392 |
IV.C 抗体を用いた検定法 393 |
IV.C.1 免役沈降法 (細井和雄) 393 |
a. EGF受容体の[32P]による標識と分析 393 |
b. [125I]I2による細胞表面膜蛋白質の標識と特異抗体による免役沈降 398 |
c. 融合蛋白質の免役沈降 400 |
IV.C.2 ウエスタンブロッティングとドットブロッティング法 (樋口富彦) 402 |
a. SDS/ureaポリアクリルアミドゲル電気泳動 402 |
b. ウエスタンブロッティング法 406 |
c. ドットブロッティング法 407 |
d. ラジオイムノアッセイ 407 |
e. 化学発光法 410 |
IV.C.3 ELISA (山本良平) 413 |
a. 測定の原理 414 |
b. 測定に必要な試薬 415 |
c. 固相の調製 418 |
d. 酵素標識法 419 |
e. 測定法 420 |
f. 測定系の評価 422 |
IV.C.4 RIA (吉竹佳乃) 424 |
a. 原理 424 |
b. 放射性同位元素による蛋白質抗原の標識 424 |
c. 反応液と抗原抗体複合体分離法(RIAの実施例) 426 |
d. 一般的なRIA系のつくり方(標識抗原量と抗体量の決定) 427 |
e. 標準曲線と感度 427 |
IV.D 免役組織化学 429 |
IV.D.1 組織の固定法と切片の作成 (天野 修) 429 |
a. 固定液の選択 429 |
b. 光学顕微鏡観察のための固定法 430 |
c. 光学顕微鏡観察のための切片作成 431 |
d. 電子顕微鏡観察のための固定法 431 |
IV.D.2 一次抗体と染色法の選択 (天野 修) 431 |
a. 切片の動物種による選択 431 |
b. 標識物の選択と抗体の標識 432 |
c. 切片と抗体の動物種が一致する場合 432 |
d. 二重染色 433 |
e. 抗体希釈濃度の決定 433 |
IV.D.3 光学顕微鏡的免疫組織化学法 (天野 修) 433 |
a. HRPを標識とした免役染色法 433 |
b. 蛍光染色法 436 |
IV.D.4 電子顕微鏡的免疫組織化学法 (天野 修) 437 |
a. 前包理法 437 |
b. 後包理法 438 |
IV.D.5 培養細胞の免疫組織化学 (天野 修) 439 |
IV.D.6 免疫染色の結果の判定と問題の解決 (天野 修) 439 |
a. 対照との比較 439 |
b. 吸収試験 439 |
c. 他の方法との比較 440 |
d. 抗原性賦活化法 440 |
IV.D.7 実験例 441 |
a. パラフィン切片におけるFGFRの免疫染色 (吉田 純) 441 |
b. ラット組織における細胞増殖因子の検出 (天野 修) 443 |
c. 細胞外マトリックス分子とマトリックスプロテアーゼの検出 (宮崎 香) 445 |
V 遺伝子実験法 449 |
V.A 遺伝子の単離と構造解析 450 |
V.A.1 PCR法による遺伝子の増幅 (稲垣 学・内田浩二) 450 |
a. GENETYXによるプライマーのデザイン 450 |
b. DNA合成を依頼するときの注意点 452 |
c. PCR反応 452 |
V.A.2 mRNAの単離精製 (姫田敏樹・樋口富彦) 454 |
a. RNAを扱うときの注意点 454 |
b. 組織・細胞株からのtotal RNAの精製 455 |
c. Oligo(dT)LatexによるmRNAの高純度精製 457 |
d. mRNAの光学的定量 458 |
V.A.3 cDNAのクローニング 458 |
a. cDNAライブラリーの作製 (棚橋伸行・棚橋智子) 459 |
b. ランダムプライマー法によるプローブDNAの標識 (棚橋伸行・棚橋智子) 465 |
c. cDNAのクローニング (棚橋伸行・棚橋智子) 467 |
d. 5'RACE法によるmRNAの5'末端領域の解析 (姫田敏樹・樋口富彦) 472 |
e. RACE法によるmRNAの3'末端領域の解析 (姫田敏樹・樋口富彦) 474 |
V.A.4 ゲノム遺伝子のクローニング (姫田敏樹・樋口富彦) 476 |
a. ファージプレーティング用細胞の準備 476 |
b. ファージ組換え体のタイトレーション 476 |
c. レプリカフィルターの作製 477 |
d. プラークハイブリダイゼーション 478 |
e. セカンドスクリーニング 480 |
f. サードスクリーニング 481 |
g. プレートライセート 481 |
h. リキッドカルチャー 482 |
i. ファージのDNAの調製 482 |
V.A.5 サザンハイブリダイゼーション (渡邉 肇・中島亮一) 484 |
a. アガロースゲル電気泳動とブロッティング 484 |
b. ハイブリダイゼーション 486 |
V.A.6 サブクローニング (渡辺智紀・中島亮一) 488 |
a. 制限酵素 488 |
b. アガロースからのDNA断片の切り出し 489 |
c. DNA量の求め方(光学的手法) 490 |
d. 平滑末端化(プラントエンディング)反応 491 |
e. 脱リン酸化反応(BAP処理) 492 |
f. ライゲーションとトランスフォーメーション 493 |
g. プラスミドの少量調製 494 |
h. プラスミドの大量調製 496 |
i. 塩化セシウム密度勾配遠心によるプラスミドDNAの精製 497 |
V.A.7 DNAシーケンス 498 |
a. アロカオートシーケンサーによるDNAシーケンス (久保見朋子) 498 |
b. ALFオートシーケンサーによるDNAシーケンス (久保見朋子) 504 |
c. ABIオートシーケンサーによるDNAシーケンス (新垣理恵子) 509 |
d. 日立パーソナルDNAシーケンサーによるDNAシーケンス (窪川かおる) 516 |
V.B 遺伝子転写産物の解析 523 |
V.B.1 ノーザンブロッティング (姫田敏樹・新垣尚捷) 523 |
V.B.2 定量的PCR (多田 淳・津村恵子・細井和雄) 526 |
a. 2組のプライマー対を使う方法 526 |
b. 1組のプライマー対を使う方法(competitive PCR) 526 |
c. 専用装置による定量PCR 531 |
V.B.3 mRNAの絶対量の定量 (姫田敏樹・樋口富彦) 532 |
a. 鋳型DNAの準備 532 |
b. In vitro 転写系によるRNAの合成 532 |
c. ドットブロッティング 534 |
d. 合成RNAによる検量線の作製 535 |
e. 実施例 535 |
V.B.4 In situ hybridization(ISH) (赤松徹也・細井和雄) 538 |
a. 原理 538 |
b. 組織の固定 539 |
c. スライドガラスの調製 539 |
d. 組織切片の作製 539 |
e. DIG標識cRNAプローブの合成 540 |
f. ハイブリダイゼーション・洗浄・検出 541 |
V.C 転写調節領域の機能解析 544 |
V.C.1 CATアッセイ (武田京子・姫田敏樹・樋口富彦) 544 |
a. 培養細胞の取り扱いおよび基本操作 544 |
b. トランスフェクション 544 |
c. 培養細胞からの細胞抽出液の調整法 545 |
d. B-galactosidaseアッセイ 545 |
e. CATアッセイ(二層拡散法) 545 |
V.C.2 ルシフェラーゼアッセイ (上野明道・三輪佳宏) 546 |
a. スタンダードルシフェラーゼアッセイ 547 |
b. デュアルルシフェラーゼアッセイ 550 |
V.C.3 Fluorescent protein/フローサイトメトリーアッセイ (三輪佳宏・上野明道) 551 |
a. FCMによるGFPの解析 551 |
b. dsRedとEGFPを組み合わせた,2color解析 554 |
c. episomal vectorによる応用法 555 |
V.C.4 RNase Protectionアッセイ法(武田京子・樋口富彦) 556 |
a. DNA templateの作製 556 |
b. RNAプローブの作製 557 |
c. 実施例 558 |
V.C.5 ゲルシフトアッセイ法 (武田京子・姫田敏樹・樋口富彦) 558 |
a. 核抽出蛋白質の調整 559 |
b. 2本鎖DNAの作製 559 |
c. 2本鎖DNAの5'末端ラベル 559 |
d. ゲルシフトアッセイ 560 |
e. 実施例 561 |
V.C.6 BIACOREによる遺伝子と蛋白質の相互作用解析 (松田文彦・吉川竜文・澤田潤一・半田宏) 562 |
a. 実施例 : DNA結合性転写因子とDNAの相互作用の解析 563 |
b. 従来法との比較 568 |
c. 応用 568 |
V.C.7 原子間力顕微鏡による遺伝子と蛋白質の相互作用の観察法 (太田敏子・竹安邦夫) 568 |
a. 生物学における原子間力顕微鏡 569 |
b. サンプルの調整の方法 570 |
c. Height Modeとその応用 570 |
d. 蛋白質の介在するDNA高次構造をみる 571 |
e. 蛋白質のサブユニット構造をみる 574 |
V.D 遺伝子の機能解析 576 |
V.D.1 遺伝子の発現 576 |
a. 遺伝子免疫法による抗体の産生 (伊藤巧一・加藤誠志) 576 |
b. 融合蛋白質の発現 (竹内郁登・吉竹佳乃) 580 |
V.D.2 転写産物制御法 585 |
a. アンチセンス法 (村上 章・山吉麻子) 585 |
b. RNAi-新しい遺伝子機能破壊法 (新垣尚捷・大脇浩幸) 591 |
V.D.3 蛋白質―蛋白質間相互作用の検出 597 |
a. 酵母two-hybrid system (岩淵邦芳・伊達孝保) 598 |
b. 動物細胞two-hybrid system (濱田富美男・伊達孝保) 603 |
c. Far Western法(West Western法) (松井 理・伊達孝保) 605 |
V.D.4 サブトラクション法による生理機能にかかわる遺伝子の解析 608 |
a. 蛍光differential display法 (新垣尚捷・姫田敏樹) 608 |
b. サブレッション―サブトラクティブハイブリダイゼーション法 (加々美直史・末永みどり) 613 |
V.D.5 変異解析法 (馬場嘉信) 620 |
a. PDR-SSCP 621 |
b. マイクロサテライト 625 |
c. RFLP 627 |
d. DNAチップ(DNAマイクロアレイ) 628 |
V.D.6 遺伝子改変マウスの作製から系統確立まで (木藤 実) 631 |
a. トランスジェニックマウスの作製方法 631 |
b. ノックアウトマウスの作製方法 632 |
c. 遺伝子改変マウスの系統確立 634 |
V.E Genetyx とゲノムネットによる遺伝子の解析 (姫田敏樹・樋口富彦) 636 |
V.E.1 Genetyx 636 |
V.E.2 ゲノムネット 637 |
付録 分子細胞生物学に関連したデータベースの有用なサーバ紹介 (姫田敏樹) 638 |
1. ホモロジー検索などの遺伝子解析に有用なサイト 638 |
2. 転写因子の研究に有用なサイト 638 |
3. その他有用であると思われるサイト 639 |