| 序 塩見春彦 |
| 第1章 RNAiの原理 |
| 1 【総論】RNAiとは 塩見春彦 10 |
| 2 動物のmiRNA 岩崎信大郎，泊幸秀 12 |
| miRNA発見の歴史とインパクト |
| miRNAの生合成と機能 |
| miRNA解析の課題 |
| 3 植物のmiRNA 渡辺雄一郎 14 |
| 植物のmiRNAの生合成経路 |
| 植物miRNAの標的 |
| 植物miRNAの作用 |
| 植物のサイレンシングの特徴 |
| 4 小分子RNAとクロマチン動態 石田真由美，中山潤一 16 |
| クロマチン動態を制御する小分子RNAの発見と研究界へのインパクト |
| さまざまな生物におけるクロマチン動態とRNAi機構の研究課題 |
| 5 動物の内在性小分子RNA：piRNAを焦点として 塩見美喜子 18 |
| はじめに |
| PIWIサブファミリーの種類と特徴 |
| おわりに |
| 6 植物の内在性小分子RNA 野坂実鈴，佐藤豊 22 |
| 植物の内在性siRNAと生合成経路 |
| まとめ |
| 7 糸状菌（真菌）の内在性小分子RNA 中屋敷均 24 |
| 糸状菌のRNAサイレンシング経路 |
| RNAi実験への利用 |
| 8 ウイルスがコードする小分子RNA 櫻木淳一 26 |
| 発見の歴史と研究界へのインパクト |
| 機構の原理と解説 |
| 9 病原細菌の小分子RNA 清水徹 28 |
| 細菌における小分子RNA発見の歴史 |
| 細菌における小分子RNAの作用機構 |
| コラム 2本鎖RNAの発見から50年 西村暹 30 |
| 第2章 小分子RNAの解析 |
| 1 ノーザンブロットによる小分子RNAの検出 三好啓大 33 |
| 【1】 泳動とブロッティング |
| 【2】 プローブの作製 |
| 【3】 ハイブリダイゼーションと検出 |
| 2 RT-PCRによる小分子の検出 山田陽史，吉田哲郎 40 |
| ① miRNA成熟体に対するRT-PCR 40 |
| 【1】 TaqMan MicroRNA Assaysを用いたmiRNAの定量法 |
| 【2】 miScript Systemを用いたmiRNAの定量法 |
| ② その他の小分子RNAに対するRT-PCR 45 |
| 3 免疫沈降法による小分子RNA-タンパク質複合体の精製 西田知訓 46 |
| 【1】 ショウジョウバエ卵巣抽出液の作製 |
| 【2】 免疫沈降法 |
| 4 小分子RNAの単離とcDNAライブラリーの作製 齋藤都暁 50 |
| ①サイズマーカーを利用した小分子RNAの単離とクローニング 51 |
| 【1】 小分子RNAの単離とリンカーの結合 |
| 【2】 ライブラリーの作製 |
| ② 免疫沈降物に存在する小分子RNAの可視化 56 |
| ③ 免疫沈降物からの小分子RNAのクローニング 58 |
| 5 次世代シークエンシング技術の原理と小分子RNA同定への応用 佐野浩美，前田倫広 59 |
| 【1】 Single-Stranded Template DNA（sstDNA） ライブラリー調製 |
| 【2】 Capture beadの準備とエマルジョンPCR |
| 【3】 微小ビーズ回収 |
| 【1】 シークエンス用ビーズ調製 |
| 【5】 シークエンス |
| 6 小分子RNAのバイオインフォマティックス 渡部聡朗，十時泰 66 |
| 【1】 ウェブサイトを使った方法（少量解析） |
| 【2】 プログラムを用いた方法（大量解析） |
| 7 マイクロアレイを用いたmiRNAの大規模発現解析 村上善基，安田剛 71 |
| 【1】 マイクロアレイの作製 |
| 【2】 RNA抽出 |
| 【3】 ラベリング |
| 【4】 ハイブリダイゼーション |
| 8 whole mount in situハイブリダイゼーションによるmiRNAの発現解析 三嶋雄一郎，井上邦夫 77 |
| 【1】 プローブの調製 |
| 【2】 胚の固定 |
| 【3】 プローブのハイブリダイゼーションおよび検出 |
| 9 ArgonauteファミリーメンバーのSlicer活性の解析 塩見美喜子，岡田（永海）知子 84 |
| 【1】 免疫沈降法によるArgonauteの調製 |
| 【2】 標的RNAの調製 |
| 【3】 標的RNA切断アッセイ法 |
| コラム 小分子RNAと幹細胞 宮川（倉持）さとみ 92 |
| 第3章 RNAiを用いた解析の応用 |
| 1 shRNAライブラリーを用いた特定分子経路の網羅的解析法 西賢二，程久美子 93 |
| 【1】 ライブラリーの構築 |
| 【2】 ヒト細胞を用いた特定分子経路の網羅的解析 |
| 2 有効なsiRNAのデザインと細胞への導入 加藤敬行,鈴木勉 99 |
| ① siRNAのデザイン法 99 |
| 【1】 siRNAの構造 |
| 【2】 siRNAの配列 |
| 【3】 活性予測アルゴリズムを用いた配列設計法 |
| ② siRNAの導入法 101 |
| 3 マウスにおけるRNAiの誘導とその評価法 蓮輪英毅，伊川正人，岡部勝 103 |
| ① RNAiトランスジェニックマウスの作製 103 |
| 【1】 RNAiトランスジーンの作製 |
| 【2】 RNAiトランスジーンの導入 |
| ② RNAiトランスジェニックマウスの評価（siRNAの検出） 105 |
| ③ グリーンマウス（EGFPトランスジェニックマウス）を用いた実験例 108 |
| 4 ショウジョウバエにおけるRNAiの誘導 影山裕二，佐藤仁泰 109 |
| ① dsRNAの顕微注入によるRNAiの誘導 109 |
| 【1】 顕微注入用ガラス針の作製 |
| 【2】 dsRNAの調製 |
| 【3】 顕微注入 |
| 【4】 dsRNAを注入した胚の回収 |
| ② トランスジーンを利用したRNAiの誘導 114 |
| 【1】 PCRによる標的領域の増幅とpENTR/D-TOPO vectorへのクローニング |
| 【2】 LR clonaseを用いたpRISEへのクローニング |
| 【3】 顕微注入法による形質転換 |
| 5 RNAiの植物への応用 堀孝一,渡辺雄一郎 118 |
| ①さまざまなRNAi法の特長 118 |
| 【1】 人工的に合成された2本鎖RNA（dsRNA）を導入する方法 |
| 【2】 細胞内でdsRNAを生産するコンストラクト（ヘアピンRNAベクター）を導入する方法 |
| 【3】 ウイルスベクターによる方法 |
| 【4】 RNAi誘導ベクターの設計と構築 |
| 【5】 標的領域の選択 |
| ② ウイルスベクターによるRNAiの実験法 120 |
| 【1】 RNAi誘導ウイルスベクターの構築 |
| 【2】 in vitro転写による感染性RNAの調製 |
| 【3】 感染 |
| 【4】 感染性の確認 |
| 【5】 感染葉すりつぶし液の調製 |
| 【6】 観察 |
| コラム siRNAの医薬品への応用 嶋本顕 126 |
| 索引 128 |
| 上巻索引 132 |
